疫苗的制作方法
【专利说明】疫苗 发明领域
[0001] 本发明涉及治疗逆转录病毒感染的新活性剂组合和方法，所述逆转录病毒感染包 括HIV感染和AIDS。尤其，本发明涉及以刺激受试者中体液免疫的化合物和/或在受试者中 诱导细胞介导的免疫应答的肽；和免疫调节化合物和/或储库清除剂（reservoir purging agents)，比如组蛋白去乙酰化酶（HDAC)抑制剂的组合治疗的新方法。
[0002] 发明背景
[0003] 近年来，已经积累了大量研宄证据，其支持这样的概念，即AIDS是由HIV-I引 起的免疫疾病，而不是简单地由作为慢性细胞病变病毒感染结果的CD4+T淋巴细胞的损 失导致。因此重要的是开发也靶向由HIV-I引起的慢性免疫刺激的干预。（Sommerfelt 2011，Recent Translational Research in HIV/AIDSEd. Dr. Yi-ffei Tang. ISBN 979-953-307-189-2. pp 493-510).
[0004] 抗逆转录病毒治疗（ART)以消除HIV-I感染的失败处于这样的观察结果，即HIV-I 在潜伏的储库（reservoirs)中仍然是静息的。潜伏地感染的休眠⑶4+细胞（幼稚细胞或 持久存活的记忆细胞）携带转录沉默的HIV-I并代表HIV-I感染的主要储库。其他细胞 也可以用作储库（在Alexaki等人，2008, Curr. HIV Res. 6 :388-400中综述），比如巨噬细 胞，树突细胞和星形胶质细胞（其中，HIV-I感染通过不依赖CD4的机制发生）。代表消灭 HIV-I感染的主要挑战的就是这些潜伏储库。针对消灭的方法包括尝试通过在存在ART的 情况下选择性活化潜伏的感染细胞（比如记忆细胞）以清除储库，从而释放的病毒不感染 相邻细胞和在相邻细胞中复制（Richmanetal.，2009, Science 323:1304-1307)。药剂包括 组蛋白去乙酰化酶抑制剂，细胞因子，比如IL-2和IL-7,以及苔藓抑素（bryostatin)，蛋白 激酶C活化剂（Kovochichetal.，2011，PLoS ONE 6(4) :el8270)。治疗性疫苗具有这样的 优点：能够穿透不能由ART很好接近的庇护位点比如淋巴组织（Pantaleo等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :9838-42 ;Fox 等人，1991，J. Infect. Dis. 164 :1051-57)和中枢神 经系统（Alexaki等人，2008, Curr. HIV Res. 6 :388-400)，其代表病毒持续感染的区域。这 涉及靶向病毒自身以及HIV-相关免疫活化的治疗性干预。
[0005] 以提供可以安全和有效用于治疗与TNF-α异常产生相关的疾病的化合物为 目的，已经进行了很多研宄。参见，例如，Marriott，J.B·，等人，Expert0pin·Biol· Ther. (4) :1-8(2001) ;G.W· Muller，等人，Journal of Medicinal Chemistry，39(17): 3238-3240(1996);和 G.W. Muller，等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 8:2669-2674(1998)。一些研宄集中于由于其通过LPS刺激的PBMC有效抑制TNF-α产 生的能力而被选择的一组化合物。L. G. Corral，等人，Ann. Rheum. Dis.，58 (增刊I): 1107-1113(1999)。这些化合物，常被称为免疫调节化合物，不仅显示对TNF-α的有效抑 制，而且显示对LPS诱导的单核细胞ILlB和IL12产生的显著抑制。LPS诱导的IL6还被 免疫调节化合物抑制，尽管是部分抑制。这些化合物是LPS诱导的ILlO的有效刺激剂。特 别实例包括，但不限于，如在US 6281230和US 6316471中描述的取代的2-(2,6-二氧代哌 啶-3-基）邻苯二甲酰亚胺和取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基）-1-氧代异吲哚。单核 细胞/巨噬细胞功能是先天免疫系统的部分，其用作针对感染第一道防线。通过调节宿主 的单核细胞和巨噬细胞，免疫调节化合物可以改变响应病毒感染，比如流感的动力学。
[0006] 组蛋白去乙酰化酶（HDAC)是从组蛋白上的N-乙酰化的赖氨酸去除乙酰基团的一 类酶。目前在哺乳动物中已经鉴定了 18种HDACs。基于细胞定位，功能和序列相似性，它们 被分为四种类型。类型I包括HDACs 1，2, 3,和8,发现其主要在核中。类型II HDACs (HDACs 4, 5,6, 79,和10)主要在胞质中发现，但可能能够在核和胞质间穿梭；类型IIa包括四种 HDACs (HDACs 4, 5, 7和9)，而类型IIb包括两种HDACs (HDACs 6和10)，其仅在胞质中表达。 HDACl 1 (遍在表达）与类型I和类型II HDACs二者共有序列相似性，并且代表类型IV。类 型ΠΙ(也称为"sirtuin家族"）归类为NAD+-依赖型蛋白，其不主要作用于组蛋白。
[0007] 之前的研宄显示针对HIV-I gpl20羧基端C5结构域的抗体与较低的免疫活化作 用和较慢的疾病进展有关（Loomis-Price 等 1998J. Inf Dis. 178 :1306-1316 ;Warren RQ 等 1991 J. Clin Immunol 11 :13-21 ;Lifson 等 1991J. Inf. Dis 163 :959-965)。实际上， 如果对此结构域的体液（即抗体）应答消失，疾病进展显示为加速（Wong等1993 J. Inf. Dis 168:1523-1527)。此外，代表5% HIV感染个体的长期不进展者（LTNP)已经维持了针 对HIV-lgpl20羧基端C5结构域的体液应答，并且尽管具有某种程度的病毒载量，但是能够 在没有抗反转录病毒治疗的情况下存活多年（Liegler等1998J. Infec. Dis. 178 :669-79 ; Gougeon 等 1996J. Tmmunol 156 :3509-20 ;Muro_Cacho 等 1995J. Immunol154 :5555-66 ; Easterbrook 等 1999J. Infect28 :71-73)〇
[0008] Gpl20的C5结构域长度为13个氨基酸（gpl20的氨基酸残基499-511，并且具有 参考序列 B. FR 83. HXB2-TKAKRRVVQREKR)。
[0009] 发明目的
[0010] 本发明实施方案的一个目的是提供可以用于预防和/或治疗逆转录病毒感染，包 括HIV感染和AIDS的治疗剂的有效组合和方法。
[0011] 本发明实施方案的一个目的是在预防和/或治疗和/或消灭HIV感染和AIDS中， 通过使用免疫调节化合物和/或储库清除剂（reservoir purging agents)，比如组蛋白去 乙酰化酶（HDAC)抑制剂，增强治疗性HIV疫苗的效果。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明人已经发现将治疗性疫苗（包括在受试者中刺激体液和/或细胞介导的免 疫应答的化合物）与免疫调节化合物和/或储库清除剂组合是有利的。
[0014] 因此，在第一个方面，本发明涉及在感染有此病毒的人中治疗人逆转录病毒感染， 比如人免疫缺陷病毒I(HIV)感染的方法，所述方法包括以任意顺序分开，顺次或同时施用 (1)在受试者中刺激体液免疫的化合物和/或一种以上在受试者中诱导细胞介导的免疫应 答的肽；和⑵免疫调节化合物和/或储库清除剂，比如组蛋白去乙酰化酶（HDAC)抑制剂。
[0015] 在第二个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含
[0016] a)在受试者中刺激体液免疫的化合物和/或一种以上在受试者中诱导细胞介导 的免疫应答的肽；和
[0017] b)免疫调节化合物和/或储库清除剂，比如组蛋白去乙酰化酶（HDAC)抑制剂。
[0018] 在进一步的方面，本发明涉及在感染此种病毒（比如HIV)的人中降低和/或延迟 发生人逆转录病毒感染，比如免疫缺陷病毒I (HIV)的风险或人逆转录病毒感染，比如免疫 缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括以任意顺序顺次施用或同时施用（I) 在受试者中刺激体液免疫的化合物和/或一种以上在受试者中诱导细胞介导的免疫应答 的肽；与⑵免疫调节化合物和/或储库清除剂，比如组蛋白去乙酰化酶（HDAC)抑制剂组 合。
[0019] 发明详述
[0020] 定义
[0021] 除非另外说明，当在本公开内容中使用术语诸如"一种（one)"、"一个（a)"或"一 个（an)"时，它们是指"至少一个"，或者"一种或多种"。另外，术语"包括（comprising)" 意在指"包含（including) "并且因此除明确说明的那些外还允许出现其他组分、特征、条件 或步骤。
[0022] 可以由根据本发明的组合治疗的人逆转录病毒包括：
[0023] HTLV-I (最初称为人T-细胞白血病病毒-现在称为人类嗜T淋巴细胞病毒）；
[0024] HTLV-II (人T-细胞白血病病毒，现在也称为人类嗜T淋巴细胞病毒）；
[0025] HIV-I (早期也被称为LAV-淋巴结病病毒，也称为人类嗜T淋巴细胞病毒III即 HTLV-III)；
[0026] HIV-2 (也被称为HTLV-IV);以及任意上述病毒的任意亚型；和
[0027] 除非另有说明，"HIV"通常表示人免疫缺陷病毒1。
[0028] "HIV疾病"由若个阶段组成，包括本身通常表现为类流感症状的急性HIV感染， 以及具有若个非特征症状的早期和中期阶段症状疾病，所述非特征症状诸如皮瘆、疲劳、盗 汗、轻微体重减轻、口腔溃疡、和由真菌引起的皮肤和指甲感染。大多数HIV感染者在发展 出更严重的疾病前将经历诸如这些的轻微的症状。通常认为，最早的轻微症状需要五至七 年来显现。随着HIV疾病的进展，一些个体会变得相当不健康，即使他们还未被诊断出患有 AIDS(见以下），HIV疾病的晚期。典型的问题包括慢性口腔或阴道腐烂（vaginal thrush) (真菌引起的瘆或斑），嘴上的复发性疱瘆疱（herpes blisters)(感冒疮（cold sores))或 生殖器上的复发性疱瘆疱，持续的发烧，持久的腹泻，以及显著的体重减轻。"AIDS"是晚期 HIV疾病，并且是一种这样的病症，其逐渐地减弱免疫系统的有效性并且使个体易遭受机会 性感染和肿瘤。
[0029] 当本文使用术语"gpl20"时，是指gpl60的~ 120kDa的N端糖蛋白酶切产物， gpl60相应地是HIV env基因的唯一表达产物。gpl20在传染性HIV病毒体上形成"刺突 (spike) "并且与gp41非共价结合。
[0030] "gp41"指示~ 41kDa的糖蛋白，是gpl60的C端酶切产物。gp41定位于HIV感染 的膜或病毒体内。gp41具有与gpl20非共价结合的N端跨膜结构域。本文中把该跨膜结构 域称为"gp41的跨膜结构域"或"tm-gp41"。所述术语在其范围内包括如例如在式III中 所示的那些序列的天然存在的突变版本。
[0031] "C5"或"C5结构域"指示gpl20的13个C端氨基酸残基。
[0032] "C2"或"C2结构域"指示gpl20中的保守区域。C2中的区域与在gpl20的内部近 端结构域中的C5形成反平行β折叠。
[0033] 在本文的情形中，"降低和/或延迟HIV的病理学作用"意指使用本发明的方法来 提供在根据本发明治疗的HIV感染个体中观察到的发病率的统计学显著减小和/或延迟。 换句话说，与非治疗对照相比，AIDS特有的明显疾病症状的发作时间较晚，和/或与未接受 本发明治疗的对照相比病理学表现的数量得到减少。
[0034] 表述"HIV gpl20的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gpl20的恒定C2结 构域的缔合"是指C5能够与tm-g41和C2中的一种或两种非共价地相互作用。与tm-gp41 的相互作用是分子间的，而与C2的相互作用是分子内的。
[0035] "能够稳定HIV gpl20的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gpl20的恒定 C2结构域的结合的药剂"是物质的组合，其预防或在统计学上减少C5从其与gp41的分子间 结合和/或从其与C2的分子内结合释放。通常，这种药剂是能够发挥此作用的任何物质， 但是重要的实例是抗体，抗体片段，和抗体类似物。然而，对于一方面在C5和tm-gp41和/ 或另一方面C2之间的复合物具有适当结合亲和性的其他分子，也是依照本发明的药剂一一 准确的分子形式不如结合特性重要，并且根据本发明同样有可能的是，这种药剂不仅可以 是受体或受体类似物，而且还可以是能够充当本发明药剂的小分子稳定剂。
[0036] 本文中的术语"抗体"在最广义上使用并且特定地包括全长单克隆抗体，多克隆 抗体，多特异性抗体（例如，双特异性抗体），以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活 性，即充当上述药剂。在例如 Harlow 等（Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y·，（1988)·)中提供了与抗体制备相 关的多种技术。
[0037] "抗体片段或抗体类似物"包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合或可变区。抗 体片段/类似物的实例包括Fab、FaV、F(ab) 2、F(ab'）2、F(ab)3、Fv (典型地抗体单臂的 VL和VH结构域）、单链Fv (scFv)、dsFv、Fd片段（典型地VH和CHl结构域），和dAb (典 型地VH结构域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体（minibodies)、双链抗体 (diabodies)、三链抗体（triabodies)、四链抗体（tetrabodies)和 κ 抗体（kappa body) (见例如，111 等，Protein Engl997 ;10 :949-57);骆驼 IgG ;IgNAR ;和由抗体片段、和一个 或多个分离的CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残 基或多肽可以结合或连接在一起，以致形成功能抗体片段。在例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol 2005 ;23,1126-1136 ;W02005/040219,以及公布的美国专利申请 20050238646 和20020161201中，已经描述或综述了不同类型的抗体片段。
[0038] 术语"抗体衍生物"，如在本文中使用的，包括全长抗体或抗体片段，优选地至少包 括其抗原结合区或可变区，其中例如为了将所述抗体与第二分子相连，将一个或多个氨基 酸化学修饰，例如，通过烷基化、聚乙二醇化、酰基化、形成酯或形成酰胺等进行化学修饰。 这包括但不限于，聚乙二醇化抗体、半胱氨酸-聚乙二醇化抗体和其变异体。
[0039] 如本文所使用的，"缀合物"包括与第二药剂缔合或连接的根据本发明要使用的 药剂（诸如抗体衍生物），所述第二药剂诸如细胞毒性剂、检测剂等。缀合物可以由共价连 接的肽组成（缀合物的一个实例是融合肽，所述融合肽包含经由肽键相连的两个肽，以致 在所述情况中的缀合物可以是源自核酸片段的表达产物），而缀合物也可以是通过化学缀 合共价相连的肽的组合（常规的实例是使用戊二醛缀合）。更复杂的缀合的另一个实例是 其中本发明的药剂或肽多聚体或其他化学物质与载体分子相连的实例，所述载体分子又与 本发明的其他药剂、肽多聚体或其他化学物质偶联（例如当这种化学物质与聚赖氨酸载体 (赖氨酸"树"）结合时）。
[0040] "人源化"抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。 就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白（接受体（recipient)抗体），其中来自接受 体高变区的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的来自非人物种（供体抗体）高变区 的残基代替，所述非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物。在一些实例中，人免疫球 蛋白的构架区（FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含未在接受体 抗体或在供体抗体中发现的残基。作出这些修饰以进一步完善抗体表现。通常，人源化 抗体将基本上包含所有或至少一个，并且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有 的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋 白序列的那些残基。人源化抗体也可以可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区（Fe)，典 型地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。进一步的细节见例如，Jones等，Nature 321: 522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988);和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)、W0 92/02190、美国专利申请 20060073137 和美国专利 6, 750, 325、 6, 632, 927、6, 639, 055、6, 548, 640、6, 407, 213、6, 180, 370、6, 054, 297、5, 929, 212、 5, 895, 205、5, 886, 152、5, 877, 293、5, 869, 619、5, 821，337、5, 821，123、5, 770, 196、 5, 777, 085、5, 766, 886、5, 714, 350、5, 693, 762、5, 693, 761、5, 530, 101、5, 585, 089 和 5, 225, 539。
[0041] 具有参比抗体"生物学特性"的抗体是这样的抗体，其具有使其区别于与相同抗原 结合的其他抗体的所述抗体的一种或多种生物学特性。
[0042] 在本文的情形中，术语"肽"意指2至10个氨基酸残基的短肽，11至100个氨基 酸残基的寡肽，和超过100个氨基酸残基的多肽。当提及肽中的氨基酸时，除非提供其他信 息，意图是所述氨基酸是L-氨基酸。除非另有陈述，氨基酸由其标准三字母或单字母名称 表示。本文中提及的一些不常见氨基酸包括通常缩写为Har的高精氨酸，通常缩写为Nle 或Nl的正亮氨酸，通常缩写为Lys (Me)的N- ε -甲基化的Lys，通常缩写为Cit或以单字目 表示的"B"的瓜氨酸，通常缩写为Dpr的二氨基丙酸和通常缩写为Dpr(Ser)的丝氨酰