提高谷胱甘肽的组合物及其用图

提高谷胱甘肽的组合物及其用图
【专利说明】提高谷胱甘肽的组合物及其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及提高细胞和组织中还原型谷胱甘肽水平的组合物及其用途。更具体 地，本发明涉及含疏基的短肽在以谷胱甘肽失调为特征的血液疾患（blood disorder)的治 疗中及在生物样品的保存中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 血液疾患是影响包括红血细胞、白血细胞和血小板的血液组分的一种或更多种的 医学状况。
[0004] 例如，血红蛋白病是包括有缺陷的血红蛋白（Hb)生成的一组遗传性血液疾患。不 同的血红蛋白病分成两个主要的组：地中海贫血综合征，以结构正常的珠蛋白亚基的减少 合成为特征；及血红蛋白结构变体（异常血红蛋白）综合征，以结构异常的珠蛋白亚基的合 成为特征。两组皆由珠蛋白相关基因中的突变和/缺失引起。一些血红蛋白病为混合型， 其结合了两个主要组的特征。血红蛋白病最通常的临床表现包括严重程度多变的贫血和多 变的病理生理。
[0005] 在常染色体隐性疾病地中海贫血综合征中，珠蛋白链生成的减少可由基因缺失或 突变产生，所述基因缺失或突变不利地影响HiRNA产物的转录或稳定性。地中海贫血的主要 类型为由4个α-珠蛋白基因的一个或更多个中的缺失或突变产生的α-地中海贫血，和 由2个β-珠蛋白基因的一个或更多个中的缺失或突变产生的β-地中海贫血。
[0006] 地中海贫血的两个主要类型基于其严重程度和受到影响的基因拷贝的数目被进 一步分类。β _地中海贫血包括轻型β _地中海贫血（β -thalassemia minor)(也被称作 β-地中海特征（β-thalassemia trait))、中间型β-地中海贫血和重型β-地中海贫血 (也被称为库利贫血（Cooley's anemia))。通常，如果1个β-珠蛋白基因受到影响，结果 是轻型地中海贫血。如果2个β-珠蛋白基因受到影响，结果是中间型或重型地中海贫血， 取决于基因受到多么严重的影响。基因可被突变或甚至完全地被缺失。
[0007] α -地中海贫血包括静止型携带者状态（silent carrier state)，其中1个基因 受到影响；α -地中海贫血特征（a -thalassemia trait)，其中2个基因受到影响；血红蛋 白H病，其中3个基因受到影响；及重型α-地中海贫血（也被称为巴氏血红蛋白胎儿水肿 (Hb Bart's hydrops fetalis))，其中4个基因受到影响。后者为通常在子宫内（in utero) 被诊断出的严重状况，并且具有重型α-地中海贫血的胎儿通常被流产、为死胎、或出生后 很快死亡。
[0008] 除了减少的血红蛋白生成之外，地中海贫血的表现由于导致的链失衡而更加恶 化：在α-地中海贫血中，β-珠蛋白链和/或γ-珠蛋白链过度生成。相似地，在β-地 中海贫血中，α-链过度生成。血红蛋白链失衡损害红血细胞、缩短其寿命、并且有时甚至 将其破坏，导致贫血。
[0009] 在为常染色体显性状况的血红蛋白结构变体综合征中，珠蛋白链的结构缺陷是由 于在α链或β链中改变了的氨基酸序列造成的。至今已描述了数以百计的血红蛋白变体， 其大多数在临床上是良性的或可以忽略的。然而，有一些与病理有关。临床上值得注意的 变体被分成4组。第一组包括具有聚集趋势的变体，其与镰状细胞综合征有关，例如HbS变 体。生成HbS的β -珠蛋白基因中的点突变通过导致HbS的沉淀和聚合致使红细胞镰状化 而发挥其作用。这些镰状化的细胞缺乏可变形性，堵塞微血管，并导致坏死和组织梗死，其 表现为疼痛型镰状细胞危象。永久性变形的细胞随后在健康红细胞通常的120天寿命的很 久之前被从循环中清除，促成慢性非溶血性和/或溶血性贫血。该临床表现通常仅在具有 纯合型镰状细胞病的个体中发生。
[0010] 第二组Hb变体包括伴随异常血红蛋白合成的变体，例如HbE。第三组包括具有沉 淀趋势的变体，其与溶血（易碎的红血细胞）有关，例如Hb Κ??η。第四组包括伴随异常氧 气运输和先天性红血球增多症，例如Hb Johnstown，或伴随先天性发绀（异常高铁血红蛋 白，HbM异常，例如，M-Iwate)的变体。
[0011] 不同血红蛋白病的治疗取决于疾病的严重程度。例如，造血干细胞移植是对严重 类型的地中海贫血的优选治疗。支持性而不是治愈性治疗包括终生定期输血，连同铁螯合。 治疗镰状细胞病症状的药物包括镇痛药、抗生素、皮质类固醇、ACE抑制剂及羟基脲。
[0012] 越来越多的实验和临床证据指向氧化应激在血红蛋白病中发挥的重要的作用。例 如，以前已经证明源自患有β-地中海贫血和镰状细胞贫血的患者的血细胞，包括红血细 胞（RBC)、血小板和多形核嗜中性白细胞（PMN)，处在氧化应激下-其活性氧物质（ROS)比 正常的高且其还原型谷胱甘肽（GSH)水平比正常的低。地中海贫血中的氧化应激被认为主 要由RBC异常引起，即，不稳定的Hb降解导致游离的珠蛋白链和亚铁血红素。另一个起作 用的因素是由增加的肠吸收和输血治疗引起的铁超载。一些研宄表明，在地中海贫血血浆 中升高的自由基及含铁化合物水平的存在，所述自由基及含铁化合物可能是从受损的RBC 中释放的。
[0013] 血红蛋白病中的氧化应激可解释临床症状，例如贫血是由于在循环中成熟RBC的 短暂存活期。血小板的氧化应激能对其经受激活和聚集的升高的趋势及在这些患者中血栓 栓塞并发症的高发率做出解释。PMN的长期氧化应激可导致失效的杀菌活性，其可引起复发 性感染。
[0014] 已知与氧化应激有关的另外的血液疾患是溶血性尿毒综合征（HUS)。HUS是由红 血细胞的异常过早破坏导致的状况。它经常发生于由大肠杆菌（Escherichia coli)的胃 肠道感染之后，所述大肠杆菌的胃肠道感染产生破坏细胞的有毒物质。该状况也与包括志 贺氏杆菌（Shigella)和沙门氏菌（Salmonella)的其它胃肠道感染，及非胃肠道感染和其 它因素诸如药物不良反应和服药过量有关联。受损的红血细胞经常阻塞肾脏中的过滤系 统，这可最终导致危及生命的肾衰竭。HUS的治疗可包括补液、RBC灌输、血小板灌输、血浆 置换、肾透析、及药物治疗诸如皮质类固醇。
[0015] HUS被发现涉及RBC脂质过氧化、还原性谷胱甘肽（GSH)水平和受损的代谢、还原 性抗氧化物酶活性（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）及异常血红蛋白 代谢物水平的变化。提出在HUS的急性期，RBC被暴露于氧化应激，其可通过氧化性损伤和 /或通过膜通透性和受损的膜流动性直接地促成溶血。
[0016] 另一种已知与还原性GSH水平、氧化应激和红血细胞的破坏有关的疾患是葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD)缺乏症。G6H)缺乏症是以酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异常低水 平为特征的X-连锁隐性遗传性疾病。这种酶是参与戊糖磷酸途径的代谢酶，戊糖磷酸途径 在红血细胞代谢中特别重要。G6H)也在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)的生成 中发挥重要作用。NADPH通过还原氧化型谷胱甘肽（GSSG)对还原型谷胱甘肽再生是必需 的。G6H)缺乏的红血细胞因此高度易受到氧化性损伤的攻击并倾向于发生溶血。
[0017] G6H)缺乏症最常见的临床表现包括新生儿黄疸、急性溶血性贫血和蚕豆病，其通 常由外源性试剂引发，例如毒素、氧化剂和某些食物，最值得注意的是蚕豆（fava bean)。一 些G6H)变体导致慢性溶血。G6H)缺乏症的最有效管理是避免已知在G6PD缺乏症患者中启 动溶血的药物或物质。
[0018] 因此，需要用于治疗与降低的还原型谷胱甘肽（GSH)水平和/或氧化应激有关的 血液疾患的有效的组合物和方法。
[0019] 其中氧化应激被认为发挥作用并促成细胞的破坏或损伤的另一种示例性情况是 生物样品的保存。
[0020] 例如，从个体中获取的血液样品通常被加工并被贮存直到需要时用于使用（输血 和/或分级分离）。全血或包含例如红血细胞浓缩物（压紧红血细胞）和血小板浓缩物的 加工过的血液制品被贮存于旨在使在最大允许贮存时间期间保持最佳生活力和功能的条 件下。例如，红血细胞典型地被贮存于在2-8°C的柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖（CPD)和/或 盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇（SAGM)溶液中。血小板典型地被贮存于20-24°C伴随充分 不停的搅动以允许良好的氧合作用（oxygenation)并防止聚集。
[0021] 通常，用于血液保存的添加剂溶液（additive solution)包括抗凝剂、作为能量 来源的糖、作为用于调整PH和渗透压的试剂的无机盐、及作为用于防止血液ATPU 7S-S 磷酸）、ADP(腺苷二磷酸）和AMP(腺苷一磷酸）消耗的剂的腺嘌呤。除了以上提到的CPD 和SAGM之外，其他已知的添加剂溶液包括甘露醇-腺嘌呤-磷酸盐（MAP)和磷酸盐-腺嘌 呤-葡萄糖-鸟苷-盐水-甘露醇（PAGGSM)。
[0022] 然而，即使在现在的最佳贮存条件下，也在样品中发生血液成分的更改和/或降 解。这些被称为"储存损伤"的改变影响贮存的血液制品的寿命和质量。
[0023] 红血细胞，例如，经历生物化学改变，诸如以下的水平的降低：GSH，ATP，其为多种 细胞过程所必需的，及2, 3-二磷酸甘油酸（2, 3-DPG)，其对氧气释放是重要的。也发生生 物力学的变化，诸如改变的形状、可变形性、可聚集性、弹性和细胞内粘性。起因于氧化应激 和进行性溶血的蛋白修饰也被观察到。红血细胞的贮存时间目前在最优条件下被限制到约 5-7周。血小板储存损伤典型地包括在GSH水平上的减少、形态学改变、血小板活化和血小 板蛋白水解。它们的贮存时间目前在最优条件下被限制到长达5天。
[0024] 为了在保持其功能和生活力的同时延长贮存时间，需要用于贮存生物材料诸如红 血细胞的改良的组合物和方法。
[0025] 包含巯基（-SH)的化合物是一类能中和几种类型的破坏性氧化物质的分子，因此 充当还原剂。这组化合物的活性主要地是由于它们包含的硫原子，其参与对有毒亲电体的 亲和攻击、清除自由基、通过氢电子给予实现受损靶的修复、改变细胞的氧化还原态、或影 响基因转录或蛋白功能。
[0026] 包含巯基的化合物包括由所有活生物体包括动物和植物生成的天然分子，以及合 成分子。包含巯基的天然抗氧化剂的实例包括为哺乳动物中最有效且重要抗氧化剂之一的 还原型谷胱甘肽、硫氧还蛋白和半胱氨酸。
[0027] 合成的含有疏基的氧化还原分子的实例包括N-乙酰半胱氨酸酰胺。Grinberg等 (2005)Free Radic Biol Med, 38(1) ; 136 - 145使用人类红血细胞作为模型测试了 N-乙酰 半胱氨酸酰胺的抗氧化和保护作用。
[0028] Amer 等（2008) Biochim. Biophys. Acta, 1780 (2) : 249-55 描述了 N-乙酰半胱氨酸 酰胺作为抗氧化剂在β-地中海贫血小鼠和患者的血细胞中的体外（in vitro)和体内（in vivo)作用。
[0029] WO 2002/034202公开了以以下为特征的抗氧化化合物：(a)肽，所述肽包括至少 3个氨基酸残基，其中至少2个为半胱氨酸残基，每一个具有用于实现抗氧化作用的易被 氧化的巯基基团；及至少2个肽键，每一个可被至少一种细胞内肽酶裂解；及（b)通过第 一键被连接至肽的氨基末端的第一疏水或不带电荷的部分，及通过第二键被连接至肽的羧 基末端的第二疏水或不带电荷的部分，选择第一疏水或不带电荷的部分和第二疏水或不带 电荷的部分以使提供具有膜混溶性质的抗氧化化合物，以允许抗氧化化合物穿过细胞膜； 其中所述至少2个肽键被至少一种细胞内肽酶的裂解导致多个抗氧化物质（antioxidant species)的生成，每一个包括具有易被氧化的巯基基团且也在实现抗氧化作用中具有活性 的半胱氨酸残基之一，从而提供在发挥抗氧化作用中协同作用的多个不同的抗氧化物质。
[0030] 本发明的发明人和其他人的WO 2012/098546公开了具有组合的抗氧化性、抗炎 性、抗辐射和金属螯合性质的有效化合物。公开了具有所述性质的短肽及此类短肽在临 床和化妆品应用中的方法和用途。除了其它的肽以外，公开了 CyS-LyS-Met-CyS(SEQ ID NO:I)、Cys-Met-Lys-Cys (SEQ ID NO:2)和 Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3)。
[0031] 依然存在对更有效和/或安全的组合物及可有助于满足以上所述需要的方法的 需求。
[0032] 发明概述
[0033] 本发明涉及合成的含巯基的肽作为治疗剂和保护剂用于相比之前用已知肽所实 现的更有效地保存血液、血液组分、细胞和器官的生活力和功能的用途。这些含巯基的肽可 用于临床和研宄应用中的治疗剂和保护剂中，在所述临床或研宄应用中血液、血液组分、细 胞和器官的生活力和功能至少部分地由于还原型谷胱甘肽水平的消耗被损害，或在其中血 液、血液组分、细胞和器官的生活力和功能可通过提高还原型谷胱甘肽水平被改善。顺从用 本发明的肽治疗的应用包括以在血细胞内的还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH:GSSG)之间的 失衡比例为特征的血液疾患，及生物样品的保存。
[0034] 本文中使用的高度有效的肽化合物包含位于两个半胱氨酸残基之间的独特的二 肽序列，即在二肽序列的任一末端的侧翼为半胱氨酸残基，任选地还包含N-末端和C-末端 修饰。如本文中第一次公开的，发现这些肽能够提高GSH水平和/或有利于还原型谷胱甘 肽地平衡GSH = GSSG比例，并缓解细胞内的氧化应激。不被任何特定的理论或作用机制所束 缚，预计平衡的GSH:GSSG比例改善本文所具体描述的血液疾患的至少一些临床表现。还预 计平衡的GSH = GSSG比例促进所保存的细胞和组织的持续的生活力和功能。
[0035] 在一些实施方案中，肽的氨基末端和羧基末端被适当的封闭基团封闭。合适的氨 基末端封闭基团包括但不限于乙酰基、烷基（alkyl)和酰基。合适的羧基末端封闭基团包 括但不限于酰胺、酯和醇。本文例示的封闭基团包括N-乙酰基基团和C-末端酰胺基团。
[0036] 根据一方面，本发明提供了用于治疗需要其的受试者中与谷胱甘肽失调有关的血 液疾患的方法，该方法包含对受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含具有选自由以 下组成的组的氨基酸序列的至少一种肽或其盐作为活性成分：
[0037] Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID ΝΟ:1)；
[0038] Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2);及
[0039] Cys-β -Ala-His-Cys(SEQ ID N0:3)〇
[0040] 根据另一方面，本发明提供了包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的至少 一种肽或其盐作为活性成分的药物组合物：
[0041] Cys-Lys-Met-Cys(SEQ ID N0:1)；
[0042] Cys-Met-Lys-Cys(SEQ ID NO:2);及
[0043] Cys-β-Ala-His-Cys(SEQ ID NO:3),
[0044] 用于在与谷胱甘肽失调有关的血液疾患的治疗中的用途。
[0045] 在一些实施方案中，疾患以红血细胞的弱功能性和低质量为特征。
[0046] 在一些实施方案中，疾患表现为伴随红血细胞过早破坏的溶血性贫血。
[0047] 在一些实施方案中，疾患选自由红血细胞的内在异常和红血细胞外源性疾患（the disorder extrinsic to red blood cell)组成的组。每一种可能性代表本发明单独的实 施方案。
[0048] 在一些实施方案中，红血细胞的内在异常选自由以下组成的组：红血细胞膜疾患； 血红蛋白生成疾患（血红蛋白病），血红蛋白生成的定性损害或血红蛋白生成的定量损害 或者两者；及红血细胞代谢的疾患。每一种可能性代表本发明单独的实施方案。
[0049] 在一些实施方案中，红血细胞膜疾患选自由遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭 圆形红细胞增多症和阵发性睡眠性血红蛋白尿症组成的组。每一种可能性代表本发明单独 的实施方案。
[0050] 在一些实施方案中，血液疾患为血红蛋白病。
[0051] 在一些实施方案中，该血红蛋白病为地中海贫血。
[0052] 在一些实施方案中，地中海贫血的类型选自由α -地中海贫血和β-地中