专利名称：拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶基因had1在植物抗干旱方面应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶/WZ)7基因在植物抗干旱方 面的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
当前，我国人口迅速增长，粮食生产面临越来越严峻的挑战。干旱逆境 伤害严重影响到了农作物的生长发育，是限制农作物产量和质量提高的主要 因素，据统计，世界干旱和半干旱地区面积占世界总面积的1/3，而我国则占 1/2，其中没有灌溉条件的旱地约占65%。目前，我国大约有10亿亩为中低 产田，其中大部分是干旱与盐碱所致，提高作物的抗旱能力和建立高抗旱性 的新品系，是当前提高粮食产量迫切需要解决的问题。虽然国际上通过多种 生物学手段来提高作物的抗旱性，但至今还没有取得突破性的研究进展，随 着分子生物学和基因工程研究的深入，国际上很多实验室也企图寻找抵抗干 旱的关键基因，拟通过基因工程技术改良作物的抗旱性，但这方面的研究进 展也仍然很缓慢。因此，认识植物对干旱的反应机制，提高植物的抗旱性， 是农业增产的重要基础。
现有研究表明，当遇到干旱胁迫时，植物体内会伴随着大量的活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)产生。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathine Peroxidase, GPX)是抵御氧化胁迫的-一种重要防御酶，其在动物和酵母中用 于清除活性氧的功能已被证实，但它在植物中的应用还曾被报道，例如它如
何应答外界胁迫，如何感受和清除非生物胁迫产生的ROS还需要进一步去探 索。因此，克隆和鉴定植物中GPX功能，并研究其与干旱的关系，具有重要 的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶基因/L4D7在提 高植物耐干旱性能上的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种拟南芥谷胱甘肽 过氧化物酶/^D7基因在植物抗干旱方面的应用。
具体应用为将//^D7基因用于构建植物表达载体并通过植物转基因方法 获得具有抗干旱性能的转基因植物。
本发明的技术方案还在于采用了一种生产抗干旱转基因植物的方法，将 基因连接在pBIB超表达融合载体转化拟南芥，构建了正义表达载体并 通过农杆菌介导法或基因枪法的开花转化野生型拟南芥，通过含有潮霉素抗 性的MS平板上筛选，得到了转基因拟南芥。
所述的宿主植物也可以为烟草。
所述的/i4D7基因，其在Genbank中的编号为AT2g43350，该基因的 cDNA长625bp，编码206个氨基酸的蛋白。
本发明通过远红外成像技术从抗氧化基因突变体中筛选和鉴定了 /MD7，其在Genbank中的编号为AT2g43350,该基因的cDNA长625bp，.编
码206个氨基酸的蛋白。通过蛋白序列分析发现其含有半胱氨酸残基，也是 植物细胞保持ROS平衡的--个清除酶，但它与动物细胞不同的是该酶为一种 非硒依赖的过氧化物酶，这种结构的不同导致了酶活性的改变。本发明通过
将//JD/基因连接在pBIB超表达融合载体转化拟南芥，试验结果发现阳性 转基因植物/^"7的表达量明显提高，该/"D/基因可用于提高农作物对干 旱的耐受程度，大大降低了农作物生长过程中水灌溉的成本，可提高农作物 的产量，具有重要的经济价值和广泛的应用前景。本发明还可以用于其它宿 主植物的转化，如转化烟草等。
试验发现，生长20d (天)的&W突变体和野生型拟南芥幼苗，经干旱 处理15d (天)后，/z"W植株出现萎焉，而野生型生长正常。
图1为干旱胁迫下WT、超表达转基因(overHADl)和hadl突变体拟南 芥离体叶片失水率的测定结果； '
图2为ABA和&02对/zW7气孔开闭的影响。
具体实施例方式
实施例1
HAD1基因蛋白活性的鉴定
采用体外表达HAD1蛋白的方法考察其是否具有过氧化物酶的活性，以 BL21为载体构建表达HAD1融合蛋白的表达载体，并在大肠杆菌中表达，通 过Glutathione resin纯化后进行了谷胱甘肽过氧化物酶活性分析，己知谷E甘 肽过氧化物酶的氧化和还原两种状态转换所需要NADPH的消耗，在340nm 波长的激发下，测定NADPH的吸光值，可以计算其消耗量，即NADPH消耗 的越多，HAD1的酶活性越高。结果表明，原核表达的HADl、Trx、TR、NADPH 和&02共同存在的情况下，OD34Dnm随着时间的变化而不断的下降。当记录 16 min时，其OD值下降了大约0.4，而以GSH作为电子供体只有小幅度的
下降。另夕卜，通过Western blotting技术检测了 HAD1氧化态和还原态的转变, 结果表明氧化态比还原态泳动速度要快，并且在Trx和TR的作用下能使氧化 态的HAD1得到还原。该结果表明了原核表达的HAD1具有过氧化物酶的活 性，且Trx很可能是HAD1氧化还原状态转换的主要电子供体。 实施例2
/i4D7基因的体内表达
利用PCR扩增技术得到的//JD/基因的启动子与GUS融合(pCMBIA1381 载体)的转基因阳性植株，以检测/WD/在拟南芥不同组织中的表达，纟且织 化学染色表明，5d (天)大小的幼苗整个植株都有强烈的表达，分别对叶、 花、根、茎、荚等不同组织进行GUS活性测定，结果表明，叶和根中的表达 量最强，而在果、荚、茎和花中的表达相对较弱；RT-PCR分析/WD/的mRNA 在不同组织的转录，同样证实了根和叶中的表达量较高；另夕卜，/^D7基因在 植物保卫细胞中表达量明显高于其它同功酶基因。
实施例3
/i4D7基因过量表达及突变体的分子表型鉴定 ' 为了证明HAD1蛋白的功能，从SALK实验室得到了其T-DNA插入突 变体(SALK—071176)，其插入位点位于第一个外显子中；用SALK实验室 提供设计的LP和RP双引物对SALK—071176进行鉴定，以野生型拟南芥基 因组DNA作为模板，PCR扩增结果表明，900 bp处有一条明显的条带，而 SALK—071176却没有出现。为了进一步鉴定纯合体，又用T-DNA左边界上 设计的引物LBal和LBbl，分别和基因组上的RP进行PCR反应，用 SALK_071176植物基因组DNA作为模板在约500 bp和700 bp处扩增出两条
明显的条带，其大小相差约200 bp。另外，RT-PCR分析表明，潜在突变体 /"D7的mRNA的转录被终止，而用转基因技术互补该基因，却能恢复iWD/ 的表达。通过突变体和野生型拟南芥的回交试验表明，F2代对甘露醇敏感性 的表型的分离比约为3:1，因此筛选的突变体应为单基因纯合突变体(/2^/7)。
将//JD/基因连接在pBIB超表达融合载体转化拟南芥，构建了正义表 达载体并通过农杆菌介导的开花转化野生型拟南芥，通过含有潮霉素抗性的 MS平板上筛选，得到了 20株转基因拟南芥，并对其中的5株进行Northom 分析，其/WD/表达水平大大提高。将过量表达的/WD/植株、野生型(WT) 和/z^Z/突变体植物种在土壤中，观察其表型，三者之间没有差异。
实施例4
基因对干旱的响应
干旱胁迫下，水分将过度蒸发，从而降低叶片表面温度。为了证实HAD1 参与干旱胁迫的耐性，通过远红外成像技术测定了移栽营养土中15d (天) 幼苗叶片表面温度变化。结果表明，干旱5d (天)后的突变体叶片表面温度 明显低于野生型，其平均温度将比野生型低大约rC，而超表达/WD7转基 因植株叶温升高，阻止了水分的过度蒸发。通过测定离体叶片的失水率的表 明了/^W失水率明显高于野生型拟南芥，当干旱处理2h后，/^W的失水率 将比野生型快约10%，而超表达植株失水明显变慢，如图1所示。
将过量表达的HAD1植株、野生型(WT)和/z"W突变体植物种在土壤 中，试验结果发现，生长15天的幼苗，然后经干旱处理7天后，A"W植株 出现萎焉，而野生型生长正常；8天后野生型开始萎蔫，80%超表达植株还表 现一定的活性；9天后进行复水试验，只有超表达植株能恢复生长。另外，
在含有5mmol/L H202的MS培养基上，H202不但影响了 突变体的根伸 长，而且也影响了真叶的正常发育。这些结果表明HAD1具有抵抗干旱和氧 化胁迫的重要功能，同时过量表达/^D/基因提高了植物耐水份亏缺能力。
实施例5 '
/"D/基因参与了 ABA和&02诱导的气孔关闭
气孔是控制水分进出细胞的重要器官，其开闭程度直接影响植物的抗旱 能力，诸多研究表明干旱条件下植物激素脱落酸(ABA)大量增加。为了 验证HAD1参与干旱胁迫的信号转导，表皮生物学实验表明，//JD7功能缺 失阻止了 ABA诱导的气孔关闭，但不能抑制ABA诱导保卫细胞&02的产 生(见图2)。酵母双杂交和GST Pull-Down实验显示，HAD1能与ABA的 负调控因子ABI2强烈的相互作用，与ABI1的作用相对较弱。 '
以上结果表明HAD1不仅具有保持14202平衡的功能，而且能直接参与 控制气孔的开闭，调节因干旱而导致的水分过度蒸发。
本发明中的///4D7基因(High amount of water loss under drought stress, HAD1)突变体(SALK—071176)是从拟南芥资源中心(ABRC， Ohio State University)获得，其基因编号为AT2g43350，该基因的cDNA长625bp，编 码206个氨基酸的蛋白。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案， 尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当
理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和
范围的任何修改或局部替换，如宿主植物的改变等，其均应涵盖在本发明的 权利要求范围当中。
权利要求
1、一种拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶HAD1基因在植物抗干旱方面的应用。
2、 根据权利要求1所述的/WD/基因在植物抗干旱方面的应用，其特征在 于具体应用为将/^D/基因用于构建植物表达载体并通过植物转基因方法获得具有抗干旱性能的转基因植物。
3、 根据权利要求2所述的/^4D/基因在植物抗干旱方面的应用，其特征在 于将/^4D7基因连接在pBIB超表达融合载体转化拟南芥，构建了正义表达 载体并通过农杆菌介导法或基因枪法转化野生型拟南芥，通过含有潮霉素抗性 的MS平板上筛选，得到了转基因拟南芥。
4、 根据权利要求一3中任一条所述的/^D/基因在植物抗干旱方面的应 用，其特征在于所述的/WD7基因，其在Genbank中的编号为AT2g43350， 该基因的cDNA长625bp，编码206个氨基酸的蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶基因HAD1(High amount of water loss under drought stress，HAD1)在抗干旱方面的应用。其中HAD1基因突变体(SALK_071176)是从拟南芥资源中心(ABRC，Ohio State University)获得，其基因编号为AT2g43350，该基因的cDNA长625bp，编码206个氨基酸的蛋白。本发明涉及到的HAD1基因可用于提高农作物对干旱的耐受程度，大大降低了农作物生长过程中水灌溉的成本，提高植物水分利用效率，并可增加农作物的产量，具有重要的经济价值和广泛的应用前景。
文档编号C12N9/08GK101381733SQ200710055090
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月3日 优先权日2007年9月3日
发明者杰 代, 宋纯鹏, 坤 李, 苗雨晨, 郭敬功 申请人:河南大学