专利名称：枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因。
背景技术：
Mills最初发现动物细胞内具有抗氧化作用的GPX，其功能被认为是防御红血球氧化引起的溶血，并将其命名为谷胱甘肽过氧化物酶。过去一直认为这是经典的GPX，现在把具有这种功能的酶命名为GPX-1.后来，Flohe研究小组纯化并分析了分布在细胞中并作用于各种有机过氧化物及H2O2的GPX，研究表明它是由4个蛋白质亚基构成的四聚体，每个亚基各含1个硒半胱氨酸，并且它是以离子化硒醇(selenol)的形式形成酶的氧化还原活性中心。大量的研究表明，哺乳动物的GPXs有着较高的催化活性，可迅速清除体内产生的多余的活性氧(R0S)，并且GPXs多数以谷胱甘肽GSH(glutathione)作为底物催化分解生物体内产生的H202。目前，根据GPXs所包含的半胱氨酸残基的不同，可简单将其分为含硒和不含硒两大类。植物中同样也存在属于GPX家族的酶类，直到最近几年，在植物中也开展了 GPXs 的功能研究，最初的研究是从烟草的叶片里克隆了与动物依赖硒的GPXs有着较高同源性的cDNA。后来从柑橘、拟南芥、和中国大白菜等多种植物中分离得到了类似基因。研究发现，不同于动物基因组GPXs核苷酸UGA终止密码子处插入的硒代半胱氨酸残基，植物基因组GPXs核苷酸序列携带的是一个半胱氨酸残基。动物中含硒代半胱氨酸残基的GPXs有较强的催化活性，而植物中多数是半胱氨酸残基，这就大大降低了 GPXs在植物中的催化作用。然而，也有人在研究柑橘的GPXs时，用硒代半胱氨酸残基代替了半胱氨酸残基，却没有出现类似于哺乳动物的GPXs的活性。植物中GPXs的结构、对底物的特异性及在植物组织的分布上都不相同，它们对抵御外界胁迫起了很重要的作用，但我们对其功能及结构特性的认识仍很有限，还需要做大量的工作。因此，克隆和鉴定植物中GPXs，研究抗逆机制以及与逆境相关基因的分子结构、 表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，可作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，进行植物品种改良。本发明是采用以下技术方案实现的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。由所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。由所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列编码的蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
所述的枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的应用。本发明从山西省农业生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣 iZiziphus jujuba Mill hupingzao)结果枝(即枣吊)cDNA文库中筛选到枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的全序列，将其命名为ZjGPXiZiziphus Jujuba glutathione neroxidase)。 生物信息学分析表明^ζ/β吁基因cDNA序列全长为510bp，编码170个氨基酸，其中包含有 16个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为19. ^KD,理论等电点为5. 00，脂肪指数为76. 69。根据枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA编码的序列，设计带有^I和5 I 酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其上游引物为 GYl的序列为5' —ACGAATTCTCATGACTAGCCAGC—3'，包含I限制性酶切位点(即有下划线部分)，三个保护碱基ACG及此蛋白的起始密码子ATG。下游引物为GY2的序列为5'— ATCCCGGGTTGAGATTCCCAAGA— 3',包含该Sim I限制性酶切位点(即下划线部分)，两个保护性碱基AT及谷胱甘肽过氧化物酶的终止密码子TGA。经限制性内切酶^I和5 I修饰后连接于植物表达载体PES (K) -LNY上，然后再经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR 鉴定、酶切鉴定、测序证明植物表达载体PES (K)-LNY-ZjiKT构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体PES (K) -\m-ZjGPX转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PES (K)-LNY-ZjiKT 构建成功。农杆菌介导基因转化拟南芥，经含卡那霉素的V2MS培养基筛选获得含有目的基因ZjGPX的转基因拟南芥植株Ttl代，经PCR鉴定目的基因证实Zj^KT成功转入拟南芥。将转基因的T2代拟南芥种子和野生型(WT)拟南芥种子均播种在加不同浓度 NaCl的1/2MS培养基上，对转吁基因植株及其T2代进行耐盐性评价，观察其生长状况， 发现转^ζ/β吁基因拟南芥植株在盐胁迫处理下长势和根系明显好于野生型(WT)拟南芥植株。将长出2片真叶的转Zj^KT基因的T2代拟南芥植株和野生型(WT)拟南芥植株进行耐盐、耐旱胁迫处理，15天后观察其生长状况，发现转Zj^KT基因的拟南芥耐盐性明显提高， 转Zj^KT基因的拟南芥耐旱性明显提高。本发明为了进一步研究Zj^KT基因在枣树体内的表达，分别对辣椒枣组培苗进行干旱、NaCl胁迫处理，研究逆境因素对Zj^KT基因表达的影响。CTAB法提取所辣椒枣组培苗的总RNA，经OD26tl值测定、甲醛变性胶电泳等方法检测证明所提RNA浓度和纯度都符合标准，质量合格。反转录所提总RNA，定量PCR检测结果分析证实Zj^KT可受干旱、NaCl胁迫等逆境因素诱导表达。此外，本发明为了进一步研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因Zj^KT及编码蛋白 ZjGPX,本发明构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-ZjGPX，实现其在大肠杆菌(五colO BL21 (DE3)中的原核表达，为该基因编码蛋白的结构、功能、调控等方面研究提供了一定的实验数据。与现有技术相比，本发明首次从枣树中分离出枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因 ZjGPX，该基因作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解GPXs在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。
图1为Zj^KT与已知基因氨基酸同源性对比树状图。图2为枣树谷胱甘肽过氧化物酶的三维结构预测图。图3为PCR目的基因产物图谱。图4为pGEX-4T-2及目的基因ZjGPX酶切图谱。图5为重组质粒的酶切鉴定图。图 6 为工程菌 ρ6ΕΧ-4Τ-2-Ζ7·β°/"Β 的 PCR 鉴定图。图 7 为诱导产物的 SDS-PAGE 分析。图8为IPTG对蛋白表达量的影响与融合蛋白的纯化。图9为PCR目的基因产物图谱。图10为PEZR⑷-LNY及目的基因的酶切图谱。图11为重组质粒的酶切鉴定图谱。图12为筛选出的转Zj^KT基因拟南芥Ttl代幼苗。图13为筛选出的转Zj^KT基因拟南芥Ttl代植株。图14为转Zj^KT基因拟南芥T1不同株系拟南芥基因检测。图15为转ZjK吁基因拟南芥和WT拟南芥种子在不同浓度的NaCl培养基上的萌发情况。图16为转ZjK吁基因拟南芥和WT拟南芥植株在不同浓度的NaCl培养基上根系的生长情况。图17为转Zj^KT基因拟南芥和WT拟南芥植株盐胁迫后生长情况的对比图。图18为转Zj^KT基因拟南芥和WT拟南芥植株干旱胁迫后生长情况的对比图。图19为RNA甲醛变性胶电泳图谱。图20为辣椒枣组培苗经不同浓度的NaCl胁迫后的Zj^KT相对表达量的对比表。图21为辣椒枣组培苗经PEG-6000胁迫(模拟干旱处理)后的Zj^KT相对表达量的对比表。
具体实施例方式实施例1 枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX的生物信息学分析
本发明从山西省农业生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣 (Mziphus jujuba Mill hupingzao)结果枝(即枣吊、落性枝)cDNA文库中筛选到枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX的全序列。将所测定Zj^KT基因序列通过Blastx搜索NCBI的核苷酸数据库，进行序列相似性分析；用DNAMar进行氨基酸序列比对并做此蛋白的进化树；用ProtParam计算蛋白质的相对分子量和理论等电点；连接至http://WWW. expasy. org/prosite进行保守序列分析；将此蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model预测其三级结构。生物信息学分析表明枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA序列为全长510bp的开放读码框(0RF)，通过在NCBI数据库Blastx搜索进行序列相似性分析表明，该蛋白与已知的其它植物谷胱甘肽过氧化物酶具有极高的同源性，与蓖麻的同源性为95%，杨树的同源性为93%，拟南芥的同源性为93% ；对Zj^KT蛋白的氨基酸序列与其它属的物种的谷胱甘肽过氧化物酶用DNAMar构建进化树，如图1所示，枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的氨基酸序列和蓖麻的GPX亲缘关系最近，7个物种的谷胱甘肽过氧化物酶被聚为5个类群，拟南芥和杨树聚为一类；玉米和高粱聚为一类；枣、葡萄、蓖麻单独聚为一类；聚类分析还表明枣谷胱甘肽过氧化物酶和6物种GPX的氨基酸同源性均达到73. 8%以上；ZjK吁基因cDNA序列全长为510bp，用ProtParam分析该序列得，它编码170个氨基酸，其中包含有16个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为19. ^KD,理论等电点为5. 00， 脂肪指数为76. 69 ；连接至http://WWW. expasy. org/prosite进行保守序列分析，结果表明该基因编码的蛋白具有一个谷胱甘肽过氧化物酶活性位点，其氨基酸序列为第31个氨基酸到第46个氨基酸“GKvLLIvNVaSkCGmT”，还有一个谷胱甘肽过氧化物酶保守肽段，其氨基酸序列为“LAFPCNQF”，即第68个氨基酸到第75个氨基酸；在蛋白质结构数据库中搜索到 ^ζ/β吁同源模型 2p5rA，用 Swiss Model 程序(http//au. expasy. org/tools/)进行同源建模(homology modeling)，推测ZjK吁基因编码蛋白的三维结构如图2所示，枣树谷胱甘肽过氧化物酶与白杨树谷胱甘肽过氧化物酶有极高的相似性，推测其可能与白杨树谷胱甘肽过氧化物酶有着相似的功能。上述生物信息学分析方法均为本领域技术人员熟知的常规技术手段。实施例2 =Zj^KT基因原核表达载体的构建 1.材料、试剂及仪器
1.1载体和菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a菌株；克隆载体pSPORTl-ZjGPX、原核表达载体 PGEX-4T-2均由山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室保存。1. 2酶与试剂盒
DNA回收试剂盒QIAquick 购自QIAGEN公司；限制性内切酶及油办I ,Sma I ,Sal I、 T4DNA 连接酶、DNA Marker (15000bp、2000 bp ladder)等均购自大连 TaKaRa (宝生物)工程有限公司。1.3试剂及仪器设备
抗生素氨苄青霉素购自上海生工生物工程服务有限公司。质粒提取、琼脂糖凝胶电泳中所用的其他试剂均购自天津天大化工。主要的仪器设备有电子天平(Sarorius BS200s_WEl)、超净工作台(上海迅博医疗设备厂Vs-840-2)、隔水式恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂Ρ -DHS)、高压灭菌锅 (Τ0ΜΥ SS-325)、高速冷冻离心机(Thero HP-62)、高速台式冷冻离心机(Beck man J-25)、 PCR扩增仪(Eppendorf AG)、UVP凝胶成像分析仪(美国BioSpectrum 600)、真空干燥箱 (ΗΕΤ0 VR-I )、水浴恒温振荡器(国华企业SHZ-82A)、电热恒温水浴锅(天津市华北实验仪器有限公司)、恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)、恒温磁力搅拌器(江苏金城国胜实验仪器厂79W-1)、DYY-6B型电泳仪(北京市六一仪器厂)、JY-DF系列电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)、Saritorius PH计、分光光度计(印pendorf BioPhotometer)。2.实验方法
2.1大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制作用CaCl2法制备大肠杆菌(五C07i)DH5a感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南，与细菌接触的液体及容器都需经过灭菌处理。2.2 PCR引物的设计与合成
根据枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA编码的序列，设计带有ife // I和5 I酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的上游引物Gl序列为5’—— TATGGATCCATGACTAGCCAGCCCA——3’，包含BamH I限制性酶切位点(即有下划线部分)，三个保护碱基TAT，及谷胱甘肽过氧化物酶Zj^KT基因的起始密码子ATG。下游引物G2的序列为5’——ATCCCGGGTCATGAGATTCCCAAGA——3’，包含fe I限制性酶切位点(即有下划线部分)，两个保护碱基AT，及谷胱甘肽过氧化物酶Zj^KT基因的终止密码子TCA。2. 3载体pGEX-4T-2的制备及目的基因ZjGPX的扩增 2. 3. 1碱裂解法快速提取质粒pGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT
碱裂解法快速提取质粒PGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT，具体步骤见精编分子生物学实验指南。2. 3.2目的基因序列的扩增
以克隆载体PSP0RT1 (携带目的片段)为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增。先利用梯度PCR技术设置不同的温度，找出最佳退火温度为61°C。PCR 反应体系=IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+离子)，dNTP μ ，上下游引物各 μ (20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3μ1，模板DNA Ιμ1(2. 3μβ/μ1 )，灭菌超纯水加至总体积为50μ1。 扩增条件为95°C预变性5 min，94°C变性1 min，61°C退火1 min，72°C延伸2 min，共40个循环，最后72°C延伸5 min。2. 4目的基因ZjGPX和载体pGEX_4T_2的BatnH I和Sma I酶切
利用BamH I和Sma I分别酶切目的基因ZjGPX的PCR产物和载体pGEX_4T_2。目的基因ZjGPX的PCR产物的酶切反应体系如下
注PCR产物的体积依据其浓度而定，最少酶切1 目的基因片段。最后加超纯水至总体积为50μ1。 载体pGEX-4T-2的酶切反应体系
权利要求
1.一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列编码的蛋白质具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征在于，该基因在提高植物抗逆性中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列以及氨基酸序列是如序列表中所示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，本发明构建植物表达载体，获得转基因拟南芥植株，对其进行耐盐性和耐旱性评价，证明该基因作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解GPXs在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。
文档编号C12N9/08GK102533809SQ20121004213
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者孟玉平, 张春芬, 张晓娟, 曹尚银, 曹秋芬, 薛华柏 申请人:山西省农业科学院生物技术研究中心, 山西维民生科技有限公司