一种人肺腺癌细胞株ha1221及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的人肺腺癌细胞株HAl 221及其建立方法。
【背景技术】
[0002]体外建立肺癌细胞系为研究肿瘤的基础和临床研究提供了极其重要的细胞实验模型。但是随着实验的不断开展，常需要对细胞系进行不断的体外传代，于是一些生物学特征会渐渐的改变或消失，所以不断建立新的细胞系已经成为研究肺癌的发病机理和探寻新的治疗方法的重要环节。
[0003]原代细胞的培养难易程度与取材时的组织类型、分化程度、年龄等密切相关，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
[0004]现有技术大多采用手术中切除的早中期病人肿瘤组织进行原代培养，包括直接将组织进行消化培养或是将病人肿瘤组织移植至小鼠体内，待成瘤后，再取出小鼠肿瘤组织进行消化培养。
[0005]胸水细胞的主要成分为淋巴细胞、粒细胞、树突状细胞、少量脱落的上皮细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞等，成分相对较为复杂，胸腔积液中的肿瘤细胞属于高分化的成熟细胞，比较脆弱，一般而言比较难培养。但是相对于原发肿瘤灶，胸水取材容易，如果能建立稳定的培养体系，对肺癌原代细胞的建立有很大的推广意义。
【发明内容】
[0006]基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的人肺腺癌细胞株HAl 221及其建立方法。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0008]—种人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法，包括以下步骤:
[0009](I)、去除中晚期肺癌病人胸腔积液中的血块，离心后得到上清液和沉淀；
[0010](2)、将步骤(I)的沉淀用两倍体积的PBS重悬，再按1:1的体积比缓慢贴壁加入到人外周血淋巴分离液的液面上，离心；
[0011 ] (3)、小心吸取分离液面交界处的液体，得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞，无菌PBS清洗，离心弃上清；
[0012](4)、使用含0.5?2wt%的青-链双抗的步骤(I)的上清液作为条件培养基培养步骤(3)的细胞；
[0013](5)、待细胞长满时，用0.25?0.5wt%的胰酶消化，离心后，用PBS将沉淀重悬成细胞悬液;所述PBS与沉淀的体积比为2?3:1;
[0014](6)、预先在干净离心管中依次缓慢贴壁加入40%的比重为1.056的percoll液和20%的比重为1.031的口6代011液；
[0015](7)、将步骤(5)的细胞悬液缓慢贴壁加入到步骤(6)的离心管中，离心；
[0016](8)、吸取40 %的per CO 11液面处的液体，无菌PBS清洗，离心弃上清，得到肿瘤细胞，使用步骤(4)中的条件培养基进行培养；
[0017](9)、重复步骤(4)-(8)—次，然后进行细胞传代，传代时，步骤(4)的条件培养基的上清液的比例每次减少20%，再相应增加20%含10 %胎牛血清的DMEM培养基，到第五代时条件培养基为加青-链双抗的10 %胎牛血清的DMEM培养基；
[0018](10)、将传代五次后的细胞注射小鼠成瘤，杀小鼠取肿瘤并消化，得到原代人肺腺癌细胞株HA1221。
[0019]在其中一些实施例中，步骤(2)所述人外周血淋巴分离液的比重为1.077。
[0020]在其中一些实施例中，步骤(I)所述离心是在4°C 1000rpm/min离心1min;步骤(2)所述离心是在20 °C 1350rpm/min升速5，降速O，水平离心25分钟；步骤(7)所述离心是在20°C2000rpm/min，升速5，降速O，水平离心25分钟。
[0021]在其中一些实施例中，步骤(4)的青-链双抗的含量为lwt%
[0022]在其中一些实施例中，步骤(4)中置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养细胞。
[0023]在其中一些实施例中，步骤(5)中所述PBS与沉淀的体积比为2:1。
[0024]本发明还提供了上述建立方法建立的人肺腺癌细胞株HA1221。
[0025]本发明创建了一种从中晚期病人的癌性胸腔积液中分离纯化肿瘤细胞进行培养并建系的方法。分离得到活力高的肿瘤细胞后，用胸腔积液加培养基进行培养，每次传代，利用上皮和内皮细胞容易脱落，而肿瘤细胞贴壁更牢固的特点，丢弃先脱落的细胞，剩下肿瘤细胞进行培养，逐步剔除内皮和上皮细胞。本发明通过以下几个特殊的处理实现了本发明的发明目的:
[0026]1、本发明的人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法中分离肿瘤细胞时采用了两次双密度梯度离心法，第一次双密度梯度离心法，得到含量较高的肿瘤细胞和部分成纤维细胞及内皮细胞，由于成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长更快，导致肿瘤细胞生长抑制甚至死亡，因此本发明利用反复贴壁法剔除成纤维细胞和内皮细胞，再次采用双密度梯度离心法，分离除去凋亡和死亡细胞，得到活力高的肿瘤细胞；
[0027]2、由于成熟肿瘤细胞在体外培养条件与体内环境变化剧烈，细胞不容易适应，容易造成生长缓慢甚至死亡，因此本发明采用了在培养初期，用自体胸腔积液加二抗为主的条件培养基，使细胞适应生长环境，视长出的细胞量适当加大含10%胎牛血清的DMEM量，逐步过渡到细胞稳定生长时不加胸腔积液上清；
[0028]3、为了得到活力高的肿瘤细胞，本发明将培养的肿瘤细胞接种至裸鼠中，通过裸鼠体内的自然筛选，那些生长能力较强的细胞群体(肿瘤细胞)继续生长存活，相对生长能力较弱的群体(包括人成纤维细胞及内皮细胞)就会慢慢丢失，再将裸鼠体内的移植瘤取出作原代细胞培养，从而得到本发明所需要的高活力的原代人肺腺癌细胞。
[0029]本发明所述的人肺腺癌细胞株HA1221已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏日期为2016年I月28日，保藏编号为CCTCC No:C201618。
[0030]与现有技术相比，本发明具有以下显著优点:
[0031]由于中晚期肺癌病人的组织标本一般难以获得，成熟的高分化肿瘤细胞较难体外培养，本发明从比较容易获得又不为病人带来痛苦的胸腔积液中分离纯化高分化的肿瘤细胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更简单方便且成功率大大提高。
【附图说明】
[0032]图1为160X光学显微镜下，细胞稀疏与密集生长的状态图；
[0033]图2分别为15000X和30000X透射电镜下的细胞内部结构图，其中2-1中，A为胞核，B为自噬体，C为核仁;2-2中，A为胞核，B为胞核，C为核仁，D为线粒体;2_3中，A腔内的微绒毛;B线粒体;C内浆网；
[0034]图3分别为500X扫描电镜下的细胞生长情况图和4000 X扫描电镜下的细胞表面结构图；
[0035]图4分别为流式细胞仪检测细胞周期结果图和细胞周期各阶段DNA含量图；
[0036]图5为染色体核型分析结果；
[0037]图6为细胞生长曲线图；
[0038]图7分别为克隆形成图和克隆形成率图；
[0039]图8为HA1229细胞体外成瘤能力检测图。
【具体实施方式】
[0040]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0041 ]本发明的人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法的主要流程为:
[0042]胸腔积液—人外周血淋巴分离液—得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞用胸腔积液加培养基进行培养—双密度梯度离心得到活力高的肿瘤细胞—反复贴壁法—剔除内皮及上皮细胞—逐步减少胸腔积液比例—直接用含胎牛血清的培养基培养—培养细胞注射小鼠成瘤—杀小鼠取肿瘤并消化—活力好的原代肿瘤细胞。
[0043]实施例1人肺腺癌细胞株HA1221的建立方法
[0044]包括以下具体步骤:
[0045](1)、将中晚期肺癌病人的胸腔积液过ΙΟΟμπι滤网除去血块，4°C1000rpm/min离心I Omin得到上清液和沉淀，将上清液吸出另外保存；
[0046](2)、在离心管中准备人外周血淋巴分离液(LTS1077，天津灏洋，比重为1.077)，将步骤I的沉淀用两倍体积的PBS重悬，