专利名称：：一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因及其表达载体和应用的制作方法一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因及其表达载体和应用
技术领域：
本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其表达载体和应用。
背景技术：
：小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物，对人类粮食安全具有举足轻重的作用。小麦生产过程中，受到诸多逆境的胁迫(如病虫害、干旱、盐溃等)，制约其产量和品质的提高。由专性寄生真菌Blumeriagraminisf.sp.tritici侵染引起的小麦白粉病是我国小麦的第二大病害，近年来出现由南向北逐渐加重之势，给小麦生产带来了越来越严重的危害。防治白粉病最经济有效的方法是使用抗病品种，但由于病原菌小种变化快，我国现有的大部分品种已逐渐失去了对白粉病的抗性。分离和鉴定新的抗白粉病基因，利用转基因技术改良和创造小麦抗白粉病新种质，为小麦抗白粉新品种的选育提供了新的路径。簇毛麦(Haynaldiavillosa,2n=14,VV),是小麦的一个野生近缘种，它高抗小麦白粉病、锈病、梭条花叶病、全蚀病等病害，并具有抗旱、耐盐、耐寒等特性，是小麦抗逆遗传改良的宝贵基因资源库。其中来自簇毛麦6VS的Pm21基因是目前抗白粉病主效基因之一，具有抗性强、抗谱广等特点，是目前为止最有效的抗白粉病基因(参考文献=ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.DevelopmentandmoIecμIarcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.)。因此，研究Pm21基因发挥抗病作用过程中所涉及的信号转导途径基因和重要的防卫反应基因，对于了解广谱抗性的分子机理，运用基因工程手段提高小麦对白粉病的抗性具有重要意义。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI。本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI，来自簇毛麦，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因编码的蛋白质HvCIPKI，其氨基酸序列为SEQIDN0.2。含有所述的类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表达载体。含有所述的类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表达载体优选以pAHC25为出发载体，将所述的HvCIPKI基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间所得。所述的类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI在培育抗白粉病小麦品种中的应用。所述的类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表达载体在培育白粉病小麦品种中的应用。有益效果本发明从簇毛麦中克隆得到了一个类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其所编码的蛋白质HvCIPKl。HvCIPKI可用于基因工程育种，将其插入表达载体pAHC25，得到该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。图1利用中国春、簇毛麦和小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL及小麦-簇毛麦的一套添加系材料对HvCIPKI基因进行染色体区段定位，将HvCIPKl定位到6V染色体短臂。1，簇毛麦；2，小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137;3，中国春(ChineseSpring);4，小麦-簇毛麦DAlV;5，小麦-簇毛麦DA2V;6，小麦-簇毛麦DA3V;7，小麦-簇毛麦DA4V;8,小麦-簇毛麦DA5V;9,小麦-簇毛麦DA6V;10，小麦簇毛麦DA7V;12，MarkerDL2000(Takala).图2HvCIPKl在簇毛麦叶片经白粉菌诱导后的RT-PCR分析0h、2h、6h、12h、24h、48h分别表示白粉病菌诱导了0h、2h、6h、12h、24h、48h的叶片cDNA样品。图3HvCIPKl过量表达载体构建图4HvCIPKl基因转化扬麦158的Ttl代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果泳道I为未转化扬麦158对照，泳道2为MarkerDL2000,泳道3为包含目的基因的质粒，泳道4-23依次为T。代再生植株(其中泳道4、5、7、13、14、15、17、18、21、22、23为阳性转化植株)，泳道24为水空白对照。图5普通小麦染色体示6簇毛麦染色体示7小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL的示8小麦-簇毛麦添加系DA6V的示图具体实施例方式实施例1簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的克隆本实验室前期利用簇毛麦受白粉菌诱导后的cDNA样品与大麦表达谱芯片BarleyIGeneChip(http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/barley,affx)进行杂交，筛选克隆了一个在簇毛麦中受白粉诱导表达的丝氨酸/苏氨酸激酶基因(Hv-S/TPK)，物理定位于Pm21所在区段，转入感病小麦扬麦158超量表达后表现高抗白粉病(CaoAZ,XingLP,etal.Serine/threoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat,PNAS,2011,108(19):7727-7732)。为进一步克隆位于簇毛麦Pm21所在区段的抗白粉病相关基因，本发明以Hv-S/TPK为出发点，筛选其周围的抗病基因类似物。大量研究表明，水稻和小麦染色体之间存在一定的共线性，其中小麦第六部分同源群染色体与水稻第2条染色体之间存在共线性，Hv-S/TPK在水稻中的同源基因位于克隆AP004093.3和AP004863.3上，这两个紧邻的克隆位于第2条染色体上且部分重叠。通过搜索Genbank，获得了水稻第2条染色体上位于Hv-S/TPK基因上下游的BAC同源序列，进一步利用水稻基因组的序列信息，围绕Hv-S/TPK的同源BAC继续筛选第六部分同源群中间区域的抗病基因类似物。围绕Hv-S/TPK的同源BAC，在小麦第六部分同源群中共查找到具有抗病基因结构的EST23个，设计了68条引物(组成49对)。49对引物在簇毛麦中均能扩增出条带，为了筛选出定位于6VS上的抗病基因类似物，本发明以6VS/6AL易位系，小麦-簇毛麦异附加系(DAlV-DA7V)(1、ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.Developmentandmolecularcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.2、L.L.Qi,S.L.Wang,P.D.Chen,D.J.Liu,B.S.Gill1998IdentificationandphysicalmappingofthreeHaynaldiaviIIosachromosome_6VdeletionlinesTAG97:1042-1046)基因组DNA为模板进行PCR扩增，最终得到6个定位于6VS上的基因。其中I个为BarIey1-14940(引物对Pltgctctccttggatacattt(SEQIDNO.3)和P2(acaaggttcagaaaggtgaaCSEQIDNO.4)),染色体定位如图1,其预测的结果显示，它包含一个完全不同于Hv-S/TPK的丝氨酸苏氨酸激酶结构域，为了研究它和Hv-S/TPK的功能差别，以及它在抗白粉病中是否和Hv-S/TPK有联系，进一步利用筛选簇毛麦叶片cDNA文库的方法克隆获得了该基因的全长序列。本发明所用的白粉菌诱导12h的簇毛麦叶片cDNA文库(陈雅萍，2005)，能够满足对簇毛麦叶片中Pm21基因和其它抗性基因、防卫基因和其它优良基因的克隆研究。cDNA片段两端经NotI和SalI酶切位点定向克隆于载体。pSPORTl能被lmmol/LIPTG(isopropylthio-β-galactoside)诱导,通过半乳糖苷启动子表达被克隆的基因。多克隆位点的设计便于用HenikofT法进行套式缺失的构建和测序，其它特征和PUC系列载体类似。为长期保存文库和减小筛库工作量，先从5个384孔板每4-5个小混合池中各吸IμI菌液,将其混合到一起，37°C扩大培养后提取质粒。每块384孔板提取80个质粒，共有400个质粒。首先用Barleyl-14940引物以上述的400个混合池质粒DNA为模板进行PCR扩增，筛选到一个阳性的混合质粒；然后取1.5μI初级混合池质粒做电击转化，涂10个LBA平板，37°C培养待其生长16h后，每平板分30个小区刮取菌落，接入含500μILBA的1.5ml离心管中培养5个小时后，进行PCR筛选。用Barleyl-14940引物以这300个小区为模板进行PCR扩增，70%以上的次级克隆池可以扩出阳性条带。其中83号次级克隆池中阳性条带最浓，取5μI83号菌液稀释200倍，每ImlLBA培养基中接种10μI。共100管菌液，用Barleyl-14940弓I物进行PCR筛选。50%的菌液可以扩增出阳性条带，其中60号菌液扩出的条带最浓。取60号菌液稀释10000倍，取10μI稀释液涂平板。用枪头挑取15-20个单克隆于500μILBA中培养，用Barleyl-14940引物进行PCR筛选。筛选出含有目标片段的混合菌液，再次稀释铺板挑单克隆，LBA中培养后进行PCR筛选，获得I个阳性克隆。测序结果表明，该cDNA克隆全长2491个碱基，序列如SEQIDNO.1所示，其中5’UTR区有404碱基，3’-UTR有692个碱基，开放阅读框(ORF)长1395bp(图5-8)，编码465个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通过对该氨基酸序列进行保守结构分析，发现它含有一个丝氨酸苏氨酸激酶活性区和一个NAF结构域。NAF结构域又名FISL结构域，由21个氨基酸残基组成，其中A、F和L残基在已克隆的CIPK(CBL-1nteractingserine-threonineproteinkinases)基因中高度保守。CIPK是一类植物特有的响应I丐信号、CBL(B_likecalciumsensorproteins)特定祀向的丝氨酸-苏氨酸激酶。经BLAST分析，该基因编码的蛋白序列与高粱中的CIPK31基因同源性最高为82%，与拟南芥CIPK2、水稻CIPKl所编码的氨基酸序列同源性分别为58%、44%。因本实验克隆的基因含有保守的NAF结构域而且与其它种属的CIPK基因有较高的同源性，故将该基因命名为HvCIPKl。实施例2白粉菌诱导后HvCIPKl的表达特征分析把簇毛麦的非诱导和诱导不同时间的样品的cDNA为模板、以引物对P3(TTCGAGGATTGGCCTAATTG(SEQID勵.5))和卩4(GCACTGATGAGCTGATGGAA(SEQIDNO.6))进行实时荧光定量qPCR分析，以管家基因Tubulin作为内参。PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MylQ，Bio-Rad，USA)上扩增并检测荧光。20μIPCR反应体系中含2XSYBRGreenPCRMasterMix10μ1,0.4nmol/yI引物P3和P4，反转录产物2μI。扩增参数为95°CIOmin,然后95°C15s、58°C30s，72°Clmin，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平定量用MyiQ系统软件进行分析。qPCR结果表明HV_S/TPK基因在簇毛麦中受白粉菌诱导上调表达，12小时期间达到最高值，随后下降并维持在较低水平(图2)。实施例3HvCIPKl基因的表达载体的构建及其转化普通小麦扬麦158把用P5(TCCCCCGGGATGGAGGAAAGGAGGACA(SEQIDNO.7))和P6(ACGCGAGCTCTTACTCCTGTGGCTGCTGT(SEQIDNO.8))从簇毛麦cDNA中扩增出来的HvCIPKl基因片段构建入转化载体pAHC-25(公知公用，参考文献ChristensenAH，QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996，5:213-218.)，用SmaI和SacI分别双酶切载体pAHC-25和目标片段HvCIPKl基因，以HvCIPKl替换pAHC25载体上的⑶S基因编码序列，连接转化大肠杆菌获得重组子，由此将目标基因克隆到强启动子Ubi的下游，获得表达载体pAHC-HvCIPKl。除草剂抗性基因(Bar基因)作为植物转化的选择标记基因(附图3)。将构建好的过量表达载体通过基因枪法转化扬麦158，挑选1200个幼胚愈伤进行基因枪轰击，轰击前在高渗培养基(MS++2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS(只有大量元素减半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2，4_D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ZTImg/L+1AA0.5mg/L+水解酿蛋白500mg/L+2,4-Dlmg/L+鹿糖30g/L+3mg/LBialaphos,pH5.8),分化筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+水解酪蛋白200mg/L+ZTlmg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8%,pH5.8)进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基(l/2MS+IAAlmg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8%，pH5.8)中。至再生苗长约5-8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共125株。提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P7(CCCTGTTGTTTGGTGTTACCSEQIDNO.9))和基因HvCIPKl内部引物P8(CTTCAATACGTTGGGATGT(SEQIDNO.10))进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序10_50ng/μI基因组模板，ΙΟμΜ的5’引物Ρ7和3’引物Ρ8各O.5μI;2·5μIIOXbuffer；2.5μI2.5mM的dNTP；1.5μ125mM的Mg2+;0·25μI(5U/μI)Taqpolymerase(TaKaRa),加水至25μI。PCR反应条件为94°C预变性3min；94°C45s,58°C45s,72°Clmin，35个循环；72°C延伸IOmin0PCR产物经8%的聚丙烯凝胶电泳检测。其中11株可以扩增约556bp的目的条带，初步鉴定为阳性植株，株系编号依次为TQ-4、TQ-5、TQ-7、Ttl-13、Ttl-14、Ttl-15、Ttl-17、Ttl-18、TQ-21、TQ-22、T0-23(附图4)。实施例4转基因植株的白粉病抗性鉴定对Ttl代转基因植株、转基因受体品种扬麦158进行了田间抗病性鉴定，对T2代转基因植株、转基因受体品种扬麦158进行了苗期离体和成株期白粉病抗病性鉴定。抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准0-2级为高抗、3-4级为中抗、5-6级为中感、7-9为高感。Ttl代成株期抗性鉴定的结果表明扬麦158表现为高感，阳性转基因植株中，除IV18和TciH表现为中感，其余阳性转基因植株均表现为中抗。T2代苗期离体抗性鉴定的两次重复结果表明扬麦158表现为高感；阳性转基因植株中，1-144-174-22和TQ-23均表现为高抗，Tc1-LTc1-S和TpI均表现为中抗。T2代成株期白粉病鉴定结果表明扬麦158表现为高感，阳性转基因植株中，Tq-14表现为高抗，Tq-17、Tq-21、T0-22和TQ-23均表现为中抗，T0-4,T0-5和Tc1-1S均表现为中感。(表2)。表2转基因植株的白粉病抗性鉴定权利要求1.一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因的蛋白质HvCIPKl，其特征在于其氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含有权利要求1所述的簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表达载体是以PAHC25为出发载体，将权利要求1所述的HvCIPKl基因插入PAHC25的SmaI和SacI酶切位点间所得。5.权利要求1所述的簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl培育抗白粉病小麦品种中的应用。6.权利要求3或4所述的含簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。全文摘要本发明公开了一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因HvCIPK1及其表达载体和应用，属于基因工程领域。HvCIPK1的cDNA序列为SEQIDNO.1及其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2。该基因为簇毛麦中首次报道，受小麦白粉病菌诱导上调表达，在小麦感白粉病品种扬麦158中过量表达该基因可以提高扬麦158对白粉病菌的抗性。HvCIPK1是簇毛麦抗病信号传导途径中的一个重要元件，可作为目的基因导入感白粉病小麦品种，提高白粉病抗性；同时探明其作用的分子机制，有助于了解白粉病的广谱抗性机制。文档编号C12N15/63GK102994528SQ20121051258公开日2013年3月27日申请日期2012年12月4日优先权日2012年12月4日发明者邢莉萍,曹爱忠,胡佳梦,钱晨,李颖波,王秀娥,陈佩度申请人:南京农业大学