一种高效的细菌转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效的细菌转化方法，其主要内容包括：(1)纳米氧化铝可用于细菌的转化；(2)革兰氏阴性菌HB101、K12可基于纳米氧化铝作用发生转化；(3)革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌可基于纳米氧化铝作用发生转化。本发明的技术和方法不要求低温条件，室温即可实现；本发明步骤简便，无热激步骤；本发明高效，细菌转化效率高于统CaCl2法；本发明不但能实现革兰氏阴性菌转化，也可以实现革兰氏阳性菌转化。因此本发明中的技术和方法简单、高效、通用，非常适合实验室科研及工程菌制备等领域。
【专利说明】
一种高效的细菌转化方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及一种基于纳米氧化铝的高效细菌转化方法。
【背景技术】
[0002]把外源基因导入受体细菌中，使之具有新的可遗传性状的过程称之为转化，是现代基因工程与分子生物学最重要的操作技术之一。转化效率的高低决定后续工作的开展，而细菌的状态是影响转化效率最关键的因素之一。目前革兰氏阳性细菌发生转化比较困难，高效成熟的技术尚处于探索之中。革兰氏阴性细菌以大肠杆菌为例感受态细胞的获得方法主要有两种，CaCl2法和电转化法，其缺陷要么是步骤复杂转化率低，要么是需要特定的仪器设备条件，且对于低温环境和细菌的对数生长状态都有较高的要求。纳米材料能引起细菌细胞膜的氧化损伤，引起皱褶甚至孔洞，造成膜功能通透性的改变。因此探究一种基于纳米材料作用的转化效率高、操作步骤简单、温度和细菌生长条件要求低、革兰氏阴性菌和阳性菌通用的细菌转化方法对分子生物学与基因工程技术领域具有重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种基于纳米铝高效细菌转化方法。本发明用纳米氧化铝处理方法实现细菌转化，可以用10ng质粒与18细胞作用获得15-1O7个转化子。
[0004]本发明的技术方案概述如下:
[0005]一种基于纳米氧化铝的高效细菌转化方法，包括以下步骤:
[0006](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml Luria-Bertani培养基,在37°C、21Orpm条件下振荡培养至0D_约为I ;
[0007](2)将(I)中的菌体按 1%接种到 1ml Luria-Bertani 培养基,在 37°C、210rpm条件下振荡培养12h ；
[0008](3)用Luria-Bertani培养基将(2)中的菌体稀释100倍，取1.5ml菌体稀释液置于灭菌的1.5ml离心管中，在室温下离心，弃上清收集细菌，离心参数为5000 X 1min ；
[0009](4)向离心管中加入浓度10mmol/L的纳米氧化铝(颗粒直径小于50nm) 100 μ I与细菌细胞震荡混匀，室温下静止作用一定时间；
[0010](5)将菌液过0.22 μ m微孔滤膜，滤除去纳米氧化铝颗粒；
[0011](6)灭菌生理盐水冲洗微孔滤膜回收细胞，在室温下离心菌液，弃上清去除残留的纳米氧化铝，离心参数为5000 X 1min ；
[0012](7)用100 μ I生理盐水重悬菌体细胞备用；
[0013](8)加入10ng质粒DNA,润轮振荡2min ；
[0014](9)加 Luria-Bertani 培养基 900 μ I,在 37°C、21rpm 条件下振荡复苏 Ih ；
[0015](10)菌液涂布在含有相应抗生素的选择性平板上，37°C培养，生长的菌落即为转化成功的克隆。
【附图说明】
[0016]图1为本发明采用的纳米铝原子力显微镜照片，其中(a)2D，(b)3D。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明:
[0018]实施例1本发明大肠杆菌HBlOl转化pBR322质粒及转化效率检测
[0019]材料:pBR322质粒、大肠杆菌HB101、纳米氧化招(颗粒< 50nm)、CaCl2
[0020]试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入1.5%的琼脂。
[0021]主要实施步骤如下:
[0022]一、本发明大肠杆菌HBlOl转化pBR322质粒及转化效率检测
[0023](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm，振荡培养，至OD600约为I ;
[0024](2)将菌体按I %接种到1mi LB培养基，37°C，210rpm,振荡培养12h ；
[0025](3)菌体稀释100倍，1.5ml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温,5000rpm,离心1min,
弃上清，收集细胞；
[0026](4)每1.5mlEP管加入1mM纳米氧化铝(颗粒直径小于50nm) 100 μ 1，室温作用9h ；
[0027](5)作用体系过0.22 μ m微孔滤膜，回收细胞，除去纳米铝颗粒；
[0028](6)灭菌的生理盐水冲洗，室温，5000rpm，离心lOmin，弃上清去除残留的纳米铝；
[0029](7)重悬菌体细胞备用；
[0030](8)取100 μ I菌体细胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,涡轮振荡2min ；
[0031](9)加 LB 液体培养基 900μ l，37°C，210rpm，振荡复苏 Ih ；
[0032](10)转化菌体倾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培养，待长出菌落后观察计数。
[0033]二、CaCl2法大肠杆菌HBlOl转化pBR322质粒及转化效率检测(作为本发明方法的对比)
[0034](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm，振荡培养，至OD600约为I ;
[0035](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm,振荡培养12h ；
[0036](3)菌体稀释100倍，1.5ml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温,5000rpm,离心1min,
弃上清，收集细胞；
[0037](4)每 1.5mlEP 管加入 1.5ml 10mM 冰冷的 CaCl2 中，轻吹，4°C作用 30min ；
[0038](5) 4°C, 5000rpm,离心 1min,弃上清，收集细胞；
[0039](6)菌体重悬于冰冷的CaCl2中，轻吹，4°C备用；
[0040](7)取100 μ I感受细胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ng pBR322质粒，轻轻摇匀，冰上放置30min ；
[0041]⑶42°C水浴，放置90s热激；
[0042](9)快速置冰浴，保持2min ；
[0043](10)加 LB 液体培养基 900μ l，37°C，210rpm，振荡复苏 lh。
[0044](11)转化菌体倾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培养，待长出菌落后观察计数。
[0045]本发明方法转化效率7.30±0.91 XlOVyg pBR322plasmid
[0046]传统CaCl2 方法转化效率 3.65±0.51 X 16/ μ g pBR322plasmid
[0047]结论:由上述结果可知，本发明方法可实现革兰氏阴性菌大肠杆菌HBlOl转化PBR322质粒，其转化效率是传统氯化钙法的20倍左右。
[0048]实施例2本发明大肠杆菌K12转化pBR322质粒及转化效率检测
[0049]材料:pBR322质粒、大肠杆菌K12、纳米氧化铝(颗粒< 50nm)
[0050]试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入1.5%的琼脂。
[0051]主要实施步骤如下:
[0052](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm，振荡培养，至OD600约为I ;
[0053](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm,振荡培养12h ；
[0054](3)菌体稀释100倍，1.5ml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温,5000rpm,离心1min,
弃上清，收集细胞；
[0055](4)每1.5mlEP管加入1mM纳米氧化铝(颗粒直径小于50nm) 100 μ 1，室温作用9h ；
[0056](5)作用体系过0.22 μ m微孔滤膜，回收细胞，除去纳米铝颗粒；
[0057](6)灭菌的生理盐水冲洗,室温，5000rpm,离心1min,弃上清去除残留的纳米氧化招；
[0058](7)重悬菌体细胞备用；
[0059](8)取100 μ I菌体细胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,涡轮振荡2min ；
[0060](9)加 LB 液体培养基 900 μ 1，37°C，210rpm,振荡复苏 Ih ；
[0061](10)转化菌体倾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培养，待长出菌落后观察计数。
[0062]本发明方法转化效率3.53 ± 1.28χ105/μ g pBR322plasmid
[0063]结论:由上述结果可知，本发明方法可以实现革兰氏阴性菌大肠杆菌K12转化PBR322 质粒。
[0064]实施例3本发明金黄色葡萄球菌转化PBR322质粒及转化效率检测
[0065]材料:pBR322质粒、金黄色葡萄球菌、纳米氧化铝(颗粒< 50nm)
[0066]试剂:LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化钠1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C灭菌20min。LB固体培养基为液体配方加入0.9%的琼脂。
[0067]主要实施步骤如下:
[0068](I)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm，振荡培养，至OD600约为I ;
[0069](2)将菌体按I %接种到1ml LB培养基，37°C，210rpm,振荡培养12h ；
[0070](3)菌体稀释100倍，1.5ml菌体稀释液/1.5mlEP管，室温,5000rpm,离心1min,
弃上清，收集细胞；
[0071](4)每1.5mlEP管加入1mM纳米氧化铝(颗粒直径小于50nm) 100 μ 1，室温作用9h ；
[0072](5)作用体系过0.22 μ m微孔滤膜，回收细胞，除去纳米氧化铝颗粒；
[0073](6)灭菌的生理盐水冲洗,室温，5000rpm,离心1min,弃上清去除残留的纳米氧化招；
[0074](7)重悬菌体细胞备用；
[0075](8)取100 μ I菌体细胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,涡轮振荡2min ；
[0076](9)加 LB 液体培养基 900 μ 1，37°C，210rpm,振荡复苏 Ih ；
[0077](10)转化菌体倾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培养，待长出菌落后观察计数。
[0078]本发明方法转化效率2.96 ±0.56x106/μ g pBR322plasmid
[0079]结论:由上述结果可知，本发明方法可以实现革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌转化PBR322 质粒。
【主权项】
1.一种高效的细菌转化方法，其特征包括以下步骤: (1)挑取新活化的细菌单克隆，接种到1mlLuria-Bertani培养基,在37°C、210rpm条件下振荡培养至0D6。。约为I ; (2)将(I)中的菌体按1%接种到1mlLuria-Bertani培养基,在37°C、210rpm条件下振荡培养12h ； (3)用Luria-Bertani培养基将(2)中的菌体稀释100倍，取1.5ml菌体稀释液置于灭菌的1.5ml离心管中，在室温下离心，弃上清收集细菌，离心参数为5000 X 1min ； (4)向离心管中加入浓度10mmol/L的纳米氧化铝(颗粒直径小于50nm)100 μ I与细菌细胞震荡混匀，室温下静止作用一定时间； (5)将菌液过0.22 μ m微孔滤膜，滤除去纳米氧化铝颗粒； (6)灭菌生理盐水冲洗微孔滤膜回收细胞，在室温下离心菌液，弃上清去除残留的纳米氧化铝，离心参数为5000 X 1min ； (7)用100μ I生理盐水重悬菌体细胞备用； (8)加入10ng质粒DNA,润轮振荡2min； (9)加Luria-Bertani培养基900μ I,在37°C、21rpm条件下振荡复苏Ih ； (10)菌液涂布在含有相应抗生素的选择性平板上，37°C培养，生长的菌落即为转化成功的克隆。
【文档编号】C12N15/74GK105886522SQ201410668128
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月20日
【发明人】邱志刚, 李君文, 丁诚实, 金敏, 谌志强, 杨栋, 王新为
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所