一种变温转染技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程领域，更加具体地，涉及一种变温转染技术。
【背景技术】
[0002]转染(Transfect1n)，指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程，亦即将DNA结构物从细胞外带入细胞内并得到转录和表达的过程。
[0003]常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染(永久转染)，其中，瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析，一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24?72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测；稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体Gpisome)存在。
[0004]线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。
[0005]由于外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶(ΑΡΗ;新霉素抗性基因)，潮霉素B磷酸转移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
[0006]转染技术又可分为化学转染法和物理转染法，其中，化学转染法包括:(I)DEAE-葡聚糖法，DEAE-葡聚糖是最早应用于哺乳动物细胞转染的试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染能成功地应用于瞬时表达的研宄，但用于稳定转染却不是十分可靠；(2)磷酸钙法，是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研宄，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA，磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解；(3)人工脂质体法，采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA，和蛋白质，此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。LipoFiterTM 脂质体转染试剂(LipoFiterLiposomalTransfect1nReagent)是一种适合于把质粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂，它可以和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。
[0007]物理法包括:(I)显微注射法，显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法，这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研宄；(2)电穿孔法，电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞，电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内，导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系；(3)基因枪法，基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞。
[0008]现有的磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔等多种技术存在各种不足，其中磷酸钙转染配液要求高，转染效率较低，且不稳定；脂质体转染效果好，脂质体价格贵，一些脂质体材料会对细胞造成影响；而显微注射、电穿孔和电子枪等方法转染成功效率高而稳定，但由于设备昂贵，普及并不广，多用于特殊要求难度高的情况。
【发明内容】
[0009]为了解决上述现有转染技术中尚存在的问题，本发明提出了一种变温转染技术。
[0010]一种变温转染技术，包括如下步骤:
1)利用培养液培养细胞；
2)收集目的细胞:
2.1)吸掉所述步骤I)中培养液的上清；
2.2)用3ml PBS清洗两次；
2.3)加入0.25%胰酶，使大部分细胞脱落悬浮起来；
2.4)加入含血清的培养液，中和胰酶，终止消化，得到细胞悬液；
2.5)对步骤2.4)中所述细胞悬液在常温下，以100rpm速度离心处理；
2.6)去除离心后得到的细胞悬液上清，得到目的细胞；
3)细胞与DNA物质混匀后进行变温:
3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鲜培养液配制得到冻存液；
3.2)在所述目的细胞中加入500 μ I新鲜培养液，再加入所述冻存液，混匀；
3.3)在_80°C条件下，冻存一夜；
3.4)在37°C条件下，解冻；
3.5)无菌条件下，在解冻后得到的液体中，加入新鲜培养液；
3.6)对将步骤3.5)中得到的液体在常温下，以100rpm速度离心处理；
3.7)利用20ng质粒和Iml培养液配制转染液；
3.8)去掉步骤3.6)中上清，并加入步骤3.7)中所述转染液，混匀；
4)培养??每3天进行一次传代培养。
[0011]较佳地，所述培养液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin_Streptomycin等原料配制，其中Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000单位青霉素(碱)和1000yg链霉素(碱)，利用0.85%盐液形式的青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素。
[0012]较佳地，所述血清包括但不限于优质胎牛血清。
[0013]本发明的基本原理和有益效果是，利用细胞在冻存和复苏过程中细胞膜松散，容易吸收外源物质的原理，通过将细胞进行物理变温，在变温过程中产生细胞膜的间隙，使外源物质进入细胞，从而达到转染的目的，所述技术用料简单，操作简单，成本低廉，无需专业设备即能做到DNA物质的转移，转染效果好，无需转染后换液且无大量特殊外源化合物对细胞的影响。
【具体实施方式】
[0014]具体实施例1
[0015]一种变温转染技术，包括如下步骤:
1)利用培养液培养细胞；
2)收集目的细胞:
2.1)吸掉所述步骤I)中培养液的上清；
2.2)用3ml PBS清洗两次；
2.3)加入2ml 0.25%胰酶，使大部分细胞脱落悬浮起来；
2.4)加入含胎牛血清的培养液，中和胰酶，终止消化，得到细胞悬液；
2.5)对步骤2.4)中所述细胞悬液在常温下，以100rpm速度离心5min ；
2.6)去除离心后得到的细胞悬液上清，得到目的细胞；
3)细胞与DNA物质混匀后进行变温:
3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鲜培养液配制得到冻存液；
3.2)在所述目的细胞中加入500 μ I新鲜培养液，再加入所述冻存液，混匀；
3.3)在_80°C条件下，冻存一夜；
3.4)在37°C条件下，解冻；
3.5)无菌条件下，在解冻后得到的液体中，加入新鲜培养液；
3.6)对将步骤3.5)中得到的液体在常温下，以100rpm速度离心处理；
3.7)利用20ng质粒和Iml培养液配制转染液；
3.8)去掉步骤3.6)中上清，并加入步骤3.7)中所述转染液，混匀；
4)培养??每3天进行一次传代培养。
[0016]其中，所述培养液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin-Streptomycin等原料配制，其中Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000单位青霉素(碱)和1000yg链霉素(碱)，利用0.85%盐液形式的青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素。
[0017]具体实施例2
[0018]使用6孔培养板培养一个孔的CHO细胞，当细胞达到80%时，进行目的细胞收集处理；吸掉上清；加入注射用生理盐水，轻轻平遥培养板，再洗掉生理盐水，重复一次；加入2ml 0.25%的胰酶，消化脱落CHO细胞；加入含胎牛血清的培养液终止消化；吹打均匀细胞，将细胞悬液加入到15ml离心管中，在室温下，以100rpm速度，离心时间5min ;离心完后倒掉上清；配制200 μ I由包括但不限于20 μ I DMS0、180ul新鲜培养液和1ng质粒组成的冻存液；将冻存液加入到所述目的细胞中，混匀后加入所述冻存液中，放入冻存盒中；将冻存盒放入_80°C过夜；第二天，取出冻存管，放入37°C水中，急速解冻；解冻完毕立即在超净工作台中向冻存管中加入新鲜培养液；并转移到15ml离心管中，以100rpm速度在室温下离心5min，离心完成后去上清，再加入由包括但不限于20ng转染质粒和Iml培养液组成的所述转染液，混匀后，将其转移到6孔板中培养。
【主权项】
1.一种变温转染技术，其特征在于所述技术包括如下步骤: 1)利用培养液培养细胞； 2)收集目的细胞: 2.1)吸掉所述步骤I)中培养液的上清； 2.2)用3ml PBS清洗两次； 2.3)加入0.25%胰酶，使大部分细胞脱落悬浮起来； 2.4)加入含血清的培养液，中和胰酶，终止消化，得到细胞悬液； 2.5)对步骤2.4)中所述细胞悬液在常温下，以100rpm速度离心处理； 2.6)去除离心后得到的细胞悬液上清，得到目的细胞； 3)细胞与DNA物质混匀后进行变温: 3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鲜培养液配制得到冻存液； 3.2)在所述目的细胞中加入500 μ I新鲜培养液，再加入所述冻存液，混匀； 3.3)在_80°C条件下，冻存一夜； 3.4)在37°C条件下，解冻； 3.5)无菌条件下，在解冻后得到的液体中，加入新鲜培养液； 3.6)对将步骤3.5)中得到的液体在常温下，以100rpm速度离心处理； 3.7)利用20ng质粒和Iml培养液配制转染液； 3.8)去掉步骤3.6)中上清，并加入步骤3.7)中所述转染液，混匀； 4)培养:每3天进行一次传代培养。
2.根据权利要求1所述技术，其特征在于所述培养液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin-Streptomycin 等原料配制，其中 Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000单位青霉素(碱)和1000yg链霉素(碱)，利用0.85%盐液形式的青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素。
3.根据权利要求1所述技术，其特征在于所述血清包括但不限于优质胎牛血清。
【专利摘要】一种变温转染技术，包括如下步骤：利用培养液培养细胞；收集目的细胞；细胞与DNA物质混匀后进行变温；传代培养。本发明的基本原理和有益效果是，利用细胞在冻存和复苏过程中细胞膜松散，容易吸收外源物质的原理，通过将细胞进行物理变温，在变温过程中产生细胞膜的间隙，使外源物质进入细胞，从而达到转染的目的，所述技术用料简单，操作简单，成本低廉，无需专业设备即能做到DNA物质的转移，转染效果好，无需转染后换液且无大量特殊外源化合物对细胞的影响。
【IPC分类】C12N15-85
【公开号】CN104611367
【申请号】CN201510017122
【发明人】易银沙, 成光杰, 戴燕山, 朱海强, 许澎, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁
【申请人】长沙赢润生物技术有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月6日