利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。
【背景技术】
[0002] 合成的基因线路经过精心设计，依据功能将基因调控装置组装起来，感受、整合、 处理细胞内的分子信息，行使一定的功能。各种合成基因线路已发展在细胞内实现可定制、 可编程的功能，包括动态行为、开关和记忆、细胞间通讯、适应性、细胞极化、数字和模拟计 算和复杂的生物合成途径。这些基因线路中大多数是通过使用有限的基因元件和昂贵、低 效的"尝试-错误"的方法构建。因此，为了简化设计和优化对活体细胞进行复杂的操作， 研发出一个大规模的、功能定义良好的合成基因元件库和相应的计算模型和模拟方法是很 有必要的。
[0003] 在针对哺乳动物的合成生物学研宄领域，工程化的合成转录激活子和抑制子是 支持可扩展的基因线路设计的一个重要的目标。目前，构建哺乳动物/真核生物转录抑 制子常用的策略是融合一个转录抑制结构域和一个工程化的DNA结合蛋白结构域，比如 锌指蛋白、转录激活子类似因子（TALE)蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引导的 CRISPR(簇状周期性间隔短回文重复序列）系统。然而，转录抑制结构域，如Krilppel相关 盒（KRAB)转录抑制结构域和mSin相互作用结构域（SID4)通常会导致靶启动子附近的表 观遗传学修饰，因而响应时间很慢。因此，这种转录抑制不适用于构建响应快速、可逆的基 因线路。
[0004] 另一种普遍存在于原核生物中的转录抑制模式是通过无功能结构域的空间位阻， 而这在真核生物中并不常见，例如，Lac抑制子（LacI)和四环素抑制子（TetR)通过低聚化 结合在启动子附近的特异DNA序列，使DNA形成一个环，从而阻止转录起始核心元件在启动 子区域的结合）。已有研宄表明，在哺乳动物基因调控的环境下，在合成基因线路中把LacI 结合位点放置在巨细胞病毒启动子（CMV)或者CAG启动子下游，可以抑制基因表达，虽然抑 制效率在哺乳动物表达系统中低于原核表达系统。类似的，在哺乳动物系统中dCas9蛋白 不融合任何转录抑制结构域也表现出弱的转录抑制功能。
[0005] TALER蛋白由若干个特异性识别DNA的串联"蛋白模块"和两侧的N-末端及C-末 端序列组成。每个"蛋白模块"包含33-35个氨基酸残基，第12、13位氨基酸残基是靶向识 别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基（RVDs)位点。TALER蛋白上的每个RVD 仅能识别一个喊基。TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一种 人工改造的限制性内切酶，是将TALER蛋白（作为DNA结合域）与限制性内切酶Fok I (作 为DNA切割域，又称抑制结构域）融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在细胞中与基因组 的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA 断裂（DSB，Double-Strand Breaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性 末端接合机制（NHEJ，Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确， 极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基 因线路。
[0007] 本发明保护的第一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：
[0008] 将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒 甲-I，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-I ;
[0009] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括1个以上（具体可为4个）shRNAl的靶序列；
[0010] 所述表达盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括1个以上（具体可为4个）shRNA2的靶序列；
[0011] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0012] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0013] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
[0014] 将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒乙-I的重组载体 乙-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNAl或shRNA2调控 所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
[0015] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0016] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
[0017] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲 下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp ;
[0018] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙 下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
[0019] 本发明保护的第二种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：
[0020] 将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒 甲-I，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-I ;
[0021] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括shRNAl-Ι的靶序列、……、shRNAl-n的靶序列，η为 2以上的自然数；
[0022] 所述表达盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括shRNA2-l的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，η为 2以上的自然数；
[0023] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0024] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0025] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
[0026] 将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒乙-I的重组载 体乙-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNAl-1、......、 shRNAl-n、shRNA2-l、……或shRNA2_n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
[0027] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0028] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
[0029] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲 下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp ;
[0030] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙 下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
[0031] 本发明保护的第三种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：
[0032] 将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒 甲-I，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-I，蛋白乙的编码基因位于表达盒丁- I ;
[0033] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括shRNAl-1的靶序列、……、shRNAl-n的靶序列，η为 2以上的自然数；
[0034] 所述表达盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括shRNA2-l的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，η为 2以上的自然数；
[0035] 所述表达盒丁 - I自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子丁、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、 靶序列丁；所述靶序列丁 - I包括shRNA3-l的靶序列、……、shRNA3-n的靶序列，η为2以 上的自然数；
[0036] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0037] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0038] 所述表达盒丁 - I中，所述启动子丁的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白甲的靶点，或，所述启动子丁的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0039] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
[0040] 将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒乙-I的重组载体 乙-I、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁- I的重组载体丁- I导入 宿主细胞，通过加入 shRNAl-1、......、shRNAl-n、shRNA2-l、......、shRNA2-n、shRNA3_l、...... 或shRNA3-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
[0041] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0042] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0043] 所述表达盒丁 - I中，所述启动子丁的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
[0044] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲 下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp ;
[0045] 所述表达盒乙-I中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙 下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp ;
[0046] 所述表达盒丁 - I中，所述启动子丁上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子丁 下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
[0047] 本发明保护的第一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的方法，包括如下步 骤；
[0048] 所述细胞甲具有特定miRNAl ;所述细胞乙具有特定miRNA2 ;
[0049] 将具有表达盒甲-II的重组载体甲-II、具有表达盒乙-II的重组载体乙-II和 具有表达盒丙的重组载体丙导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的 强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙；所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧 光颜色；
[0050] 所述表达盒甲-II自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编 码基因、靶序列甲-II ;所述靶序列甲-II包括1个以上（具体可为4个）miRNAl的靶序 列；
[0051] 所述表达盒乙-II自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动 子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编 码基因、靶序列乙-II ;所述靶序列乙-II包括1个以上（具体可为4个）miRNA2的靶序 列；
[0052] 所述表达盒甲-II中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白乙的靶点；
[0053] 所述表达盒乙-II中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋 白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的靶点；
[0054] 所