专利名称：：棒状细菌的整合子，用所说的整合子转化棒状细菌的方法以及由之得到的棒状细菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及棒状杆菌基因组中预定之DNA序列的整合。该整合作用可能有两个主要目的一是可由棒状杆菌菌株产生一种本来不应由其表达产生的特定蛋白质，或者使之过量产生某种同源蛋白质。另一个目的则可能是通过干扰基因的有效性而阻断其表达，从而导致失去相应的酶活性和细胞中反应底物的积聚。除棒状杆菌属和短杆菌属细菌外，一般棒杆菌都是迄今被认为在损伤上很棘手的;-首先因为没有适当方法使之转化，-另外是由于存在着很大的限制性障碍，致使用其他细菌来源的DNA转化时大多是无效的。最近业已证明电穿孔方法可用于转化棒杆菌。然而，如果对自身复制载体的这一转化技术是有意义的，则最好在工业上使用那些可借助染色体内之整合作用转化的细菌，即无论就其整合元件的拷数或其定位来说，此时均表现得很稳定的那些菌株。本发明的目的在于提供在棒状杆菌内整合的整合系统。本发明涉及棒状杆菌整合子(integrons)，其特征在于它包含-确保选择的基因，该基因在所述的棒状杆菌中是有效的，且下文称之为“选择基因”，-所述棒状杆菌之基因组的同源序列，其特别适应于所说的细菌。所说的“整合子”是指可在棒状杆菌基因组中具有整合性质的不能复制的载体，且这种整合子可以是线性或环状的。但一般说来，该整合子可来自于自身复制的质粒，可允许在不同宿主如大肠杆菌中合成。在整合步骤之前，最好除去选择基因以外的所有痕量非棒状杆菌来源的DNA，特别是那些参予复制过程的序列。在所说之棒状杆菌中有效的选择基因是-针对特定物质，特别是抗生素的抗性基因，-可提供明显可鉴定之表型、颜色和/或补偿作用的基因。其中更为优选的是抗生素抗性选择标记，在此情况下可以利用-赋予卡那霉素抗性的基因AphⅢ，记作KmR，-赋予氯霉素抗性的基因Cat，记作CmR。但也可以利用其他基因，特别是红霉素抗性基因。“同源序列”是指与存在于被转化之棒状杆菌内之序列相应的、或有至少80%同源性的序列，其可能涉及相同种类或不同种类的序列，且这些序列可以是合成的。这些序列将适应或不适应于下述某些方法，即在下述方法中须考虑棒状杆菌中存在的限制性屏障问题。该整合子最好作为相应的质粒形式提供，其中除整合子外还包含复制部分，其中整合子可位于允许切割之限制性位点的两侧，且最好包含不相应于整合子中之限制性位点如NatⅠ、BstXl或SacⅠ的相反重复序列。这样，在用针对已知限制性位点的酶消化时，即可直接得到整合子;因为整合子末端是互补的，这样在用于转化棒状细菌之前即可根据需要使之连接成环状。在本发明的系统中，整合子最好是作为质粒所携带的一个部分，且该质粒载体能够通过复制部分中的复制原点或复制子进行复制。根据存在于该复制暗盒中之复制子的性质，如果质粒是由棒状细菌所独具有的内源性复制子构成，该复合质粒便只能在棒状细菌内复制，但当两个不同的、各自都能在其固有宿主内复制的复制子与质粒结合时，则其可同时在棒状细菌和外来宿主如大肠杆菌中复制。在这种情况下，即可在不同于棒状菌的系统内构建质粒，这对于难于在棒状杆菌属和短杆菌属内构建的质粒是有益的。由于整合子和基因组中同时存在同源序列，故须借助重组过程将整合子插入染色体中。这样，在第一转化体中，最初克隆到整合子之多克隆位点中的基因即可在该细菌染色体中复制(见附图2a)。这样一种复制方式在检测中具有有益的工艺价值，此时基因成倍增加，致使由该基因编码的活性，特别是相应之酶活性显著增加。鉴于第一整合部分的结构相当于选择基因周围之同源序列的直接串联重复，故有可能在允许检测过表达选择基因的培养基上，基于选择发展第一整合部分而预先扩增这一结构。因此，当选择基因是抗生素抗性基因时，即可通过增加培养基中抗生素含量来选择有最大抗性的菌株，即那些应能过表达这一相应基因的菌株，而所说的基因则相当于同源序列，且相当于将插入整合子内的所有基因或DNA序列。当然，整合子最好包含除一个或多个同源序列外的、为某个有用序列编码的序列，特别是为某种有用肽或蛋白质编码的序列，所说的序列可能同源于或来自于棒状细菌，或者，是不同源的即来自其他品系的细菌，但同样是真核生物或合成来源的。这些序列最好包含能确保在棒状细菌中表达的元件，或最好在适于宿主细菌之表达元件表达的阶段插入之。在使用棒状杆菌属宿主的情况下，获得某些酶的过表达，特别是gltA或gdhA的过表达是很有意义的。正如前面指出的那样，有可能使用本发明的整合子，利用这一系统来确保破坏基因。对于破坏或取代而言，正如图26中所示，相应的基因是无活性的，从而导致由相应基因编码之酶的底物的过量产生。一般说来，整合子是以整合暗盒形式存在的，即是说除选择基因和同源序列之外，某些情况下还可混有能提供多个克隆选择位点的序列，从而允许插入任何DNA序列和/或基因。在所有情况下，为了进行基因限定，人们还试图预测出没有其他品系之复制DNA的整合子。同样也有可能预测出更复杂的整合系统，特别是另外包含有转位因子之序列的整合系统。转位因子的序列可以由棒状细菌之蛋白质编码序列以外的、可确保转位的序列组装而成，且可能涉及非转位酶编码序列的转位。在诸多转位因子中，应提到的是噬菌体Mu，特别是噬菌体miniMu形式的转位因子。在使用如噬菌体miniMu形式之转位因子的情况下，可以利用如下所述的可能成为噬菌体部分或不同原点部分的标记，例如显色标记。本发明还涉及利用得自不同棒状细菌，特别是棒状杆菌属细菌之转位因子(尤其是如图9所示的ⅠSaB1)的整合子。实施例10中给出了ⅠSaB1元件的特性，实施例11则给出了允许选择与鉴定这种类型转位因子的一般方法。本发明还涉及包含来自于已转位因子、尤其是编码转位酶和/或转位阻遏物序列的整合子。本发明的整合子可能包含全部或部分序列，特别是相应于ⅠSaB1的序列。包含噬菌体miniMu片段、同源DNA序列和选择基因的这种类型的整合结构，如借助上面描述的结构即可获得特定基因的过表达，或者在必要时则可破坏基因。后面所述的这些结构不同于前面所述的简称为“整合子”的结构。本发明还涉及借助前述整合子经整合转化作用，特别是经电转化作用引入整合子所得到的棒状细菌菌株。可利用的棒状细菌菌株中，特别适于工业生产的是乳酸发酵短杆菌(B·lactofermentum)黄色短杆菌(B·flavum)谷氨酸棒状杆菌(C·glrtamicum)栖糖蜜棒状杆菌(C·melassecola)在利用不同于棒状细菌宿主作为终宿主进行克隆选择的情况下，可在棒状细菌中构建可能的复制性质，以使整合子适应于棒状细菌。为此可向该菌株中引入除含有整合子外，还含有复制部分的质粒，或进行整合，然后经提取质粒，并用一种或多种能释放整合子的酶消化，以回收已适应的整合子，可连接或不连接已纯化的片段，并将连接产物用于整合转化;在这种情况下，限制屏障便不再构成过多的困难。在某些情况下，由棒状细菌中间体转递是有益的，特别是在DNA来源于大肠杆菌的情况下，在整合子适应于栖糖蜜棒状杆菌之前适当于乳酸发酵短杆菌可能是有利的。最后，本发明还涉及本发明之棒状细菌在工业生产中的应用，特别是涉及本发明的整合子在制备蛋白质或代谢产物方面的应用。下列实施例将进一步证实本发明的优点。图1是由复制质粒开始制备整合子的流程图，图2显示整合子的插入·经单一重组(a)·经双重重组(b)，图3显示pCGL519的结构，图4显示两个已转化菌株之卡那霉素抗性百分数与时间的函数关系，图5显示miniMu的结构，·MudⅢ1681，·MudⅢ1681-Cat，图6显示质粒pCGL107和pCGL107∷Mud+，图7显示对含有或不含miniMu之整合子的整合作用，图8显示由lac操纵之3′末端插入区开始，乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)克隆之插入段的限制图，图9显示ⅠSaB1序列，图10是ⅠSaB1的限制图，图11是质粒pCGL330的限制图，图12是质粒pCGL331的限制图。实施例1栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965之染色体DNA文库的构建与gltA基因的克隆按照Ausubel等人(1987)提出的方法制备栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965菌株的染色体DNA。用限制性核酸内切酶MboⅠ(Boehringer)消化10μg上述DNA。按Ausubel等人(1987)所述方法在蔗糖梯度上根据大小分离各DNA片段。保留大小约6-15kb的片段，用于构建DNA库。按照Birnboim和Doly(1979)的方法由随意得到的大肠杆菌GM2199菌株制备克隆pUN121(Nilsson等人，1983)的质粒。用限制性核酸内切酶BclⅠ(Boehringer)切割该质粒，使之线性化。在Ausubel等人(1987)所述条件下，用D4DNA连接酶连接1μg经BclⅠ线性化的质粒pUN121和2μg上述的6-15kbDNA片段，以构建DNA库。按照Dower等人(1988)所述程序，用电穿孔法将连接混合物引入大肠杆菌DH5α菌株中。在含有10μg/ml四环素的LB培养基上，直接选择具有重组质粒、能够生长的克隆。按Birmboim和Dloy(1979)的方法制备全部有四环素抗性之克隆的质粒。这些质粒的集合即相当于DNA文库。用栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965的DNA文库转化缺乏柠檬酸合酶活性的大肠杆菌W620菌株。在含有四环素的基本选择培养基上选择能够生长的大肠杆菌W620转化体克隆。该克隆携带有重组质粒pCGL508。克隆选择时的差异使得携带完整gltA基因的栖糖蜜棒状杆菌DNA片段局限在由两个HindⅢ位点规定的3.5kbDNA片段内。实施例2整合子pCGL519制备整合子的流程如图1所示。选定基因aphⅢ作为选择基因;当在染色体中整合拷贝时，其所赋予的抗性可高达600μg/ml卡那霉素。一般情况为25μg/ml。最初选择实施例1中制得的、具有编码栖糖蜜棒状杆菌柠檬酸合酶之结构基因gltA的3.5kbHindⅢ片段作为棒状杆菌属基因组的同源DNA片段，并将其插入多个克隆位点中的唯一位点内(HindⅢ位点)。预料对于整合策略最有用的、处于整合子边缘上的限制性位点是相当于8个核苷酸之序列的NotⅠ位点，以及BstⅩⅠ位点。限制性酶BstⅩⅠ可识别序列(CCAN5NTGG);因此它也常常切割6核苷酸序列并可能产生出多个片段。但所释放的片段可按照不同BstⅩⅠ位点内部片段的性质重新结合，最终导致分离片段的单一重组。质粒pCGL519(图3)是对产生整合子敏感之质粒的一个实例。最初是在大肠杆菌质粒的整合暗盒中进行栖糖蜜棒状杆菌的整合试验。pCGL519是由两个边缘处有NotⅠ位点、可复制和整合的片段构成的。第一个片段相当于含有多克隆位点、选择基因aphⅢ和携带编码柠檬酸合酶之gltA基因之染色体同源HindⅢ片段的整合子。第二个片段含有可在棒状细菌中复制之质粒pBLⅠ的复制部分(3kb的SspⅠ-HpaⅠ片段)、可在大肠杆菌中复制元质粒pACY184的复制部分、orip15A及反向互补之噬菌体M13的复制原点。将含有gltA基因的3.5kb之HindⅢ片段插入到大肠杆菌内的载体pCGL243中，构建成质粒pCGL159。如图1所示，在克隆选择后用pCGL519转化乳酸发酵短杆菌。当pCGL519转移到乳酸发酵短杆菌CGL2002中时，因为pBLⅠ的复制部分在大肠杆菌中失去活性，故含有复制原点的NatⅠ片段被置换。这表明了暗盒结构的一个补偿优点。实施例3整合由乳酸发酵短杆菌的质粒提取物开始，将pCGL519转移到相对于大肠杆菌有很大限制的栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965中。所提出的系统允许由栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965菌株中分离质粒pCGL519，所说的菌株相对于大肠杆菌是完全限制性的，而相对于乳酸发酵短杆菌则只是部分限制性的。如此便制得对受体菌株有修饰作用的整合暗盒。在用限制性核酸内切酶NotⅠ(Boehringer)消化来自栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965的质粒pCGL519后，用低熔点琼脂糖凝胶分离并纯化含有gltA基因和选择基因AphⅢ的整合子。使如此纯化的整合子自身连接成为环形。然后用电穿孔法(Bonamy等人，1990)，将此连接混合物引入栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965菌株中。分析在25μg/ml卡那霉素中呈现抗性之栖糖蜜棒状杆菌的克隆。得到500个转化体。已分析的50个转化体中有31个不具有质粒pCGL519，在用XbaⅠ消化后以Southern印迹法分析其中的20个。它们全都符合于gltA区域内经同源重组进行整合的结果。根据连接产物的性质(环状单体分子或线性或环状聚合分子)，可基于简单或双重“交换”的结果来解释第一整合体(integrant)。在经NotⅠ消化并与相应于含gltA基因之3.5kbHindⅢ片段的探针杂交后，在脉冲场中进行分析。经此分析，进一步证实只有一个整合子的拷贝整合。参予野生型gltA基因拷贝之复制的方式是已测知的酶活性，乘以因数1.82，此与印迹分析结果相符，且表明已整合之拷贝的样品是无活性的。对野生型菌株与由复制质粒转化之菌株所作比较的结果汇集于表1中。检测了整合的结构稳定性，发现传代30代后卡那霉素抗性细胞的百分数和柠檬酸合酶的酶活性仍是稳定的。经在含有800μg/ml，然后是1000μg/ml之过量卡那霉素，以及进一步含有1000μg/ml卡那霉素和新霉素的保温盒上选择，以扩增已整合的结构。得到直接串联的扩增产物。虽然扩增结构与卡那霉素抗性是稳定的，但此后并不能保留原来得到的柠檬酸合酶的高水平酶活性。此有可能是产生了gltA基因的特异性失活。实施例4基于miniMu的构建本实施例中选用的Mu衍生物是MidⅡ1681和MudⅡ1681-Cat(分别以KmR和CmR代表)，其大小分别为14.8kb和16.6kb(图5)。miniMuMudⅡ1681-Cat是转位子MudⅡ1681(Castilho等人，1984)的衍生物。它们具有前述转位所必需的因子(HU除外)，以及热敏感性阻遏物C的基因(调节转位酶A和B之表达的基因)、抗生素抗性基因(分别以aphⅡ和cat为代表)和lacA、lacY及lacZ′基因。后者从第8个密码子开始，并且当Mud插入到读码内时，能测知蛋白质的转导融合。将这些转位子转移到棒状杆菌中。在将转位子整合到染色体中之后，即可按实施例8中所述的方法扩增已整合的拷贝。与这种扩增相关的是，在许多情况下，也可同样地扩增整合所得到的靶基因(谷氨酸脱氢酶的结构基因)，使相应的酶活性增加高达25倍。实施例5用于miniMu转移之载体的构建整合的载体(pCGL107，图6)含有由卡那霉素抗性KmR标志(aphⅢ)中断的gdhA基因(Gdh′)、pUN121(Nilsson等人，1983)的复制子(ori)及赋予四环素抗性(TetR)和氨苄青霉素抗性(AmpR)的基因。该载体不能在乳酸发酵短杆菌中复制，而在gdhA基因的同源位点上经简单“交换”而整合(Leblon等人，1990)。MudⅡ1681-Cat从MC4100菌株中的大肠杆菌OR1836经微量转导(minimuduction)而引入整合载体pCGL107中。在所得到的不同插入中，某中一种插入仍保留大肠杆菌的lac-表型(pCGL107∶∶Mud+，图6)。可由同样的质粒制备除去了pCGL107∶∶Mud-的Mud(图6)，且其中转位酶A和B的基因经HindⅢ消化而缺失。还曾试验了其他的转移战略;将MudⅡ1681引入棒状细菌中，同时使转位子位于两个不同类型的载体上-自杀载体(非复制、非整合的)pEV11∷Mud，其涉及没有引入MudⅡ1681之基因pUC18的衍生物。-穿梭载体(pCGL229)，其具有pBL1的复制子(HindⅢ-HpaⅠ片段)、p15A复制子和Tn9的Cat基因。在Rec+大肠杆菌中，经微量转导将MudⅡ1681引入穿梭载体中。在所得的各种插入中，其中之一仍保留有Lac-表型(pCGL229∷Mud+)。可由该载体制备除去了pCGL229∷Mud-的Mud，且其中经PstⅠ消化而缺失转位酶A和B的基因。实施例6构建的电转化效能及其在乳酸发酵短杆菌中的转移利用前述载体转化大肠杆菌菌株(DH5α)及两个乳酸发酵短杆菌菌株CGL2002和CGL2005(B115)。相对于大肠杆菌DNA，这两个菌株只是部分允许的。这些实验结果列于表2中，且由此可得出如下的观察结论-在大肠杆菌中，无论是在穿梭载体pCGL229还是在载体pCGL107(其可能在大肠杆菌中复制)的情况下，当载体上存在Mud+时转化的净效率很低，但当缺失了转位基因后则呈现另一种情况。携带活性Mu之衍生物的复制质粒的这种典型现象，可能归因于其天然宿主内对Mu之转位酶的表达非常强。此表明，在上述的构建中，所利用的Mud+(MudⅡ1681和MudⅡ1681-Cat)有很好的活性。-在所试验的任何一个棒状细菌菌株中，都不可能用穿梭载体pCGL229∷Mud+或-(也不能用自杀载体pEV11∷Mud)制得转化体。在使用pCGL229之衍生物的情况下，有可能在微转导到大肠杆菌Rec+中时，其复制子pBL1是无活性的，原因在于该载体在乳酸发酵短杆菌中没有扩增能力。-在乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)中，可用整合载体pCGL107及其衍生物制得转化体。用pCGL107∷Mud+和pCGL107∷Mud-得到的转化效果是相似的。这表明当借助整合载体将MiniMuMudⅡ1681-CatA+B+引入乳酸发酵短杆菌中时，其效率是不高的。与pCGL107本身相比，所观察到的两种pCGL107衍生物的转化效率降低，确实是由于转化体质粒的长度增大所致(在pCGL107的情况下长度为10kb，在pCGL107∷Mud+的情况下为26.7kb，而在pCGL107∷Mud-的情况下为22.1kb)。实施例7对pCGL107∷Mud+在乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)中之整合作用的研究由pCGL107∷Mud+(下称pCGL320)转化菌株CGL2005(B115)可得到147个卡那霉素(25μg/ml)抗性克隆，但没有一个转化体是针对氯霉素(5μg/ml)抗性选择的。然而，经在氯霉素上选择之后，有103个这样的克隆是抗氯霉素的。从而显示Tn9的Cat基因不足以表达允许对克隆进行初步选择的单一拷贝;相反，通过以后的划痕试验检测抗性表型，发现这一表达是足够的。所得到的克隆呈现相应于在大肠杆菌中见到的lac-表型。所得到的两种类型的整合体(1型转化体为KmRCmS，2型为KmRCmR)可能分别相当于经由双重“交换”取代gdhA基因，和经单一“交换”而得到的在gdhA位点上的完整质粒的整合(图7)。作出这种解释的有关数据是-1型和2型转化体中谷氨酸脱氢酶的剂量(参见Meers等人的技术，1970)(表3)1型的7个转化体中5个(实例K2和K3，表3)完全没有gdh活性，此可被看作是由于中断基因置换了gdhA的基因。2型的5个转化体中有4个被证实有相似的gdh活性(实例KC2与KC4，表3)。-对相当于1型(K2)和2型(KC2和KC4)转化体之BamHⅠ消化产物的Southern印迹分子分析，以及用pCGL147质粒探针揭示的特征带(结果未示出)。这些结果表明，转化体gdh(K2)的分子结构进一步证实了基因的取代。同时还证实在gdhA位点处消化质粒均可得到gdh+转化体(2型(KC2和KC4)和几个1型转化体)。实施例8对可能转位的选择在氯霉素(5μg/ml)存在下，分离的菌落仍可生长，可知2型转化体(KmR和CmR)不能足以表达氯霉素抗性基因。为此，我们研究了CmR亚克隆的转化体，并希望选择Mud(其携带cat基因)的转位。这些亚克隆是以每105个细胞中有1个的频率得到的。在Xgal上复制后，这些克隆呈现从白到兰的颜色梯度(净30%兰色)。这些结果经测定β-半乳苷糖活性而得到进一步证实(表4)。此表明Mud的转位放大了氯霉素抗性，并且因蛋白质插入位点的融合而呈现出β-半乳糖苷酶活性。事实上，用pCGL107∷Mud-所作的相同实验得出同样结果，表明这些现象并不是由于转位的结果所致。实施例9质粒pCGL107∷Mud+在染色体上串联扩增的证据已证实前面分离的几乎全部克隆(KC3T4除外)都有放大了的gdh活性(表4)。另外，除个别者(KC3T4)外，β-半乳糖苷酶(按Miller，1972所述方法测定)与gdh的活性几乎是成比例的。对氯霉素乙酰转移酶的检测(按show，1975所述方法，表5)也得到同样结果。这一结果与Mud的转位相矛盾，因为转位时Mud从未带走相邻的序列。确切地说，这表明重复单元pUN-Mud-gdh在染色体上的串联扩增，使其因序列的同源性而构成边缘。这一点可由BamHⅠ、NotⅠ和XbaⅠ消化菌株KC3、KC3T1和KC3T3的基因组DNA得以证实。不仅Mud内部的BamHⅠ带(等于7kb)，而且含有Mud边缘区的带(11kb和2.4kb)也得以扩增，这一情况证实串联扩增与转位的结果正相反。此外，经NotⅠ(仅在MudⅡ1681-cat中切割一次)和XbaⅠ(仅在gdh′中切割一次)消化，明显地扩增了重复单元的2.4kb带。在无选择压力下，15代后测得β-半乳糖苷酶活性保留了活性水平的70%，表明扩增是相当稳定的。Cat和Gdh活性在25代后同样丢失30%。这一串联扩增情况使人联想到Albertini等人(1985)和Janniere等人(1985)对枯草芽孢杆菌所作实验的结果。可将已扩增克隆的β-半乳糖苷酶活性归因于在乳酸发酵短杆菌中存在、但在大肠杆菌中测不到的扩增的寄生转导(在融合了操纵子的氨苄青素抗性基因之读码区域外)。实施例10对插入之件ⅠSaB1之特性的研究经回收大肠杆菌DH5α质粒，由KC3T4的扩增之DNA开始分离插入元件。由含有前已分离之插入元件的探针探查乳酸发酵杆菌CGL2005(B115)、某些衍生株及其他棒状细菌菌株的基因组DNA。Mu内部的3.5kbPvuⅡ片段来自于KC3T4中扩增的DNA并含有插入元件，所说的片段可用于探查含有整合体及各扩增菌株(KC3T4)之BamHⅠ消化产物DNA的初始印迹。由于插入部分不含BamHⅠ位点，所以本实验可显示出至少含一个插入或插入片段的BamHⅠ基因组片段。在菌株K1-(相当于得自pCGL107∶∶Mid-之1型的取代整合体)中，出现5个带，表明存在有多个插入的拷贝(整数或非整数)。来自乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)的基因组DNA，其BamHⅠ消化产物显示出四条与K1-共有的带(大小相当于18kb、5.9kb、5kb和4.5kb);存在于其他菌株K1-、KC1-和KC3中的第五条带(大小为6.5kb)表现为在这些菌株源中菌株CGL2005(B115)之分离子内的转位。在(ⅰ)乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)与(ⅱ)乳酸发酵短杆菌CGL2002这两个不同的短杆菌谱系之间，有两条大小为18kb和4.5kb的共同带;相反，菌株CGL2002则没有另外的带。这表现了这些元件的迁移性。栖糖蜜棒状杆菌菌株给出与插入部分间的很弱的杂交信号，转译成与存在于这些菌种中者不同的其他序列。已鉴定并克隆了乳酸发酵短杆菌的第一个特异性迁移的插入元件并定名为ⅠSaB1，其可能呈现多个拷贝(基因组中的2至5个拷贝)。在扩增区域中可不同位点易于进行多重转位。其他棒状杆菌的基因组内存在有不同但已显现的序列。ⅠSaB1是由1288个碱基对构成的;因为ⅠSaB1被插入到相当于由Hediger等人(Biochemistry，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，1985)测定序列的lac操纵子之3′末端区域的片段内，故可鉴定其周边部分。ⅠSaB1在核苷酸5575与5576之间插入，并复制一个5bp的靶序列(CCGAT)(图8)。图9中给出了ⅠSaB1的整个序列，图10显示其限制性酶切图。鉴定出读码区的两个开放相，基于所给出的序列分析结果，表明其可能相应于转位酶的结构基因及转位阻遏物基因。实施例11插入元件与转位子的俘获载体在乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)之染色体中所作基因扩增研究过程中，得到ⅠSaB1插入。为了分离棒状杆菌中得以转移的所有插入元件，构建了特殊的整合载体pCGL330和pCGL331(图11和12)。这两个载体是由衍生于载体pUN121的第一片段构成的。质粒pUN121可在大肠杆菌内复制，并携带有氨苄青霉素抗性;它具有编码λ噬菌体之CⅠ阻遏物的序列，得以阻止λ噬菌体元PL启动子与四环素抗怀基因间操纵子融合的表达。Cl基因内的插入失活，因此阻遏物能使四环素抗性基因在PL的控制下在棒状杆菌内得以表达。还可以根据四环素抗性来选择插入。在SspⅠ位点处将pUN121切成线性，并与用Klenow充填的EcoRⅠ消化，pCGL107载体所得到的第二个片段融合，用以转化大肠杆菌DH5α后得到载体pCGL330和pCGL331，两者的差异在于其克隆的方向。由pCGL107衍生的EcoRⅠ片段含有适于直接转化棒状杆菌的选择基因(赋予卡那霉素抗性的aphⅢ基因)及含有gdgdhA基因元之源部分的片段(谷氨酸脱氢酶的结构基因)，其在棒状杆菌染色体中可作为整合点。对于卡那霉素抗性，可用质粒pCGL330和pCGL331电转化乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)和CGL2002的菌株。在每种情况下，转化频率差不多都是每微克10exp3，这是与质粒的整合相适应的。这些转化体(如CGL2005∷pCGL330和CGL2005∷CGL331)对四环素均很敏感，证明Cl对PL的调节在转化体中起到良好的作用。于10次传代后检测四环素抗性分离子的频率。使Cl基因失活的突变在具有整合之质粒pCGL330和pCGL331的菌株内的出现频率为每代2×10exp-6。从菌株CGL2005∷pCGL331与CGL2005∷pCGL330中分离并用PstⅠ消化四环素抗性分离子，然后从中提取基因组DNA以回收质粒。为得到四环素抗性，连接这些已经消化的DNA，并用该连接产物转化大肠杆菌的DH5α菌株。分析回收的质粒并鉴定了9个四环素抗性克隆中7个的插入元件。一种情况下(来自于CGL2005∷pCGL331)，根据在Cl内部的定位，从鉴定的ⅠsaB1中鉴定插入元件(其大小为1.2kb具有独特的AccⅠ、EcoRV和xhoⅠ位点)。在另一种情况下(来自于CGL2005∷pCGL330)则鉴定出不同ⅠSaB1的插入元件(其大小为1.0kb，具有AccⅠ，而没有EcoRV和xho位点)。俘获载体体现了转位子的功能;在大多数情况下，所得突变是一种插入;可依据四环素抗性的频率相当准确地检测出转位的频率;已鉴定了有最大迁移的元件;其中包括再分离ⅠSaB1，并鉴定不同ⅠSaB1的其他插入元件。所列各菌株的来源是大肠杆菌·DH5alphaGibcoBRL·Mc4100Casadabam(1976)·OR1836Reyes乳酸发酵短杆菌·CGL2002Bonamy等人(1990)·CGL2005(B115)Bonnassie等人(1990)栖糖蜜棒状杆菌·ATCC17965ORSAN·ATCC17965∷gltA(本申请)这些菌株中有四个已于1991年7月23日寄存在laCollectionNa-tonaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)del′InstitutPastewr(Paris)-栖糖蜜棒杆菌ATCC17965∷gltANo.Ⅰ-1124-大肠杆菌OR1836No.Ⅰ-1125-乳酸发酵短杆菌CGL2005(B115)No.Ⅰ-1126-乳酸发酵短杆菌CGL2002No.Ⅰ-1127菌株DH5alpha可在ClontechLaburatories的目录中查到，其登记号为NO.C1021-1(PaloAlto，CA，USA)，且菌株MC4100在ATCC的登记号为No.35695。表1柠檬酸合酶的比活性<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">菌株比活性相对活性ATCC179651,0411ATCC17965∷gltA1,8931,82ATCC17965(pCGL519)5,3405,13</table></tables>柠檬酸合酶比活性(微摩尔CoASH/分钟/mg蛋白质)表2具有MiniMu的载体的转化效率细菌菌株CGL2002CGL2005(B115)pCGL2295×107105106pCGL229∷Mud+2×1040n·d·pCGL229∷Mud-4×1060n·d·pCGL1071053×103104pCGL107∷Mud+5×10204×102pCGL107∷Mud-105n·d·5×102表3在初级转化中谷氨酸脱氢酶的活性水平细菌菌株Gdh比添活性(微摩尔NADPH2消耗/分钟/mg蛋白质)起始菌株km2cm2CGL2005(B115)2，18转化体km2cm2k12，0k2≤0，06k3≤0，06k4≤0，06k5≤0，06k62，18k7≤0，06转化体km2cm2KC22，24KC32，12KC42，18KC53，45KC72，06表4扩增的整合体中，β-半乳糖苷酶与谷氨酸脱氢酶的活性水平细菌菌株β-半乳糖苷酶活性谷氨酸脱氢酶比活性起始菌株CGL205(B115)3，72，48KC26，22，24KC34，52，06扩增的整合体KC3T127，918，2KC3T220，716，0KC3T348，249，6KC3T432，22，24KC3T519，78，55KC3T619，011，9KC3T734，528，0KC2T17，42，73表5扩增的菌株中CAT、βGA1与GDH活性的水平细菌菌株βgal活性eat比活性Gdh比活性起始菌株CGL2005(B115)3，7≤0，072，18初级整合K2≤0，07≤0，006K3≤0，07≤0，006初级整合KC34，52，722，06KC73，41，82扩增的整合KC3T127，919，718，2KC3T348，233，349，6KC3T432，218，42，24KC3T519，713，68，55参考文献AlbertiniA.M.andGalizziA.(1985).AmplificationofachromosomalregioninBacillussubtilis;J.Bacteriol.，1621203-1211)AusubelM.A.，BrentR.，KingstonR.E.，MooreD.D.，SeidmanJ.G.，SmithJ.A.，andStruhlK.(1987)in"CurrentprotocolsinMolecularBiology"，GreenePublishingAssociatesandWiley-InterscienceBirnboimH.C.andDolyJ.，(1979)ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNA.NucleicAcidRes.71513-1523BonamyC.，GuyonvarchA.，ReyesO.，DavidF.andLeblonG.(1990)Interspecieselectro-transformationinCorynebacteria.FEMSMicrobiologyLetters66263-270BonnassieS.OregliaJ.TrautwetterA.andSicardA.M.(1990)IsolationandcharacterizationofarestrictionandmodificationdeficientmutantofBrevibacteriumlactofermentum，FEMSMicrobiol.Letters，vol.72143-146CasadabanM.J.TranspositionandfusionofthelacgenestoselectedpromotersinE.coliusingbacteriophageslambdaandMu.J.Mol.Biol.104(1976)541-555CastilhoB.A.，OlfsonP.andCasabadanM.J.(1984)PlasmidinsertionmutagenesisandlacgenefusionwithminiMubacteriophagetransposons，J.Bacteriol.158488-495DowerW.J.，MillerJ.F.andRagsdaleC.W.，HighEfficiencytransformationofE.colibyhighvoltageelectroporation.NucleicAcidRes.16(1988)6127-6145JanniereL.，NiaudetB.，PierreE.，EhrlichS.D.(1985)StablegeneamplificationinthechromosomeofBacillussubtilis，Gene4047-55ManiatisT.，FritschEd.andSambrookJ.(1982).MolecularcloningAlaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NYMeersJ.L.TempestD.W.andBrownC.M.Glutamine(amide)2-OxoglutarateAminoTransferaseOxido-reductase(NADP)，anEnzymeInvolvedintheSynthesisofGlutamatebySomeBacteriaJ.GeneralMicrobiology64(1970)187-194MillerJ.(1972)ExperimentsinMolecularGenetics(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)p352-355NilssonB.，UhlénM.，JosephsonS.，GatenbeckS.etPhilipsonL.，1983.Animprovedpositiveselectionplasmidvectorconstructedbyoligonucléotidemediatedmutagenesis.Nuc.Acid.Res.11，8019-8030ShawW.V.(1975)Chloramphenicolacetyltransferasefromchloramphenicolresistantbacteria.Metho.inEnz.43737-75权利要求1.棒状细菌的整合子，特征在于它包含--确保在所说的棒状细菌中有效选择的基因，--所说的棒状细菌之基因组的同源序列，其中所说的序列适应于所说的细菌。2.根据权利要求1的整合子，特征在于它来源的质粒除含有整合子外，还包含复制部分，该整合子位于相当于整合子中无限制性位点之相反重复序列的两侧。3.根据权利要求2的整合子，特征在于复制部分包含在非棒状细菌内有效的复制原点。4.根据权利要求3的整合子，特征在于复制原点在大肠杆菌内是有效的。5.根据权利要求2-4中任一项的整合子，特征在于复制部分包含在棒状细菌内有效的复制原点。6.根据权利要求1的整合子，特征在于其还包含转位因子的序列。7.根据权利要求1-6中任一项的整合子，特征在于转位因子包含来自棒状细菌的序列。8.根据权利要求7的整合子，特征在于该序列来自短杆菌属。9.根据权利要求8的整合子，特征在于该序列来自如图9所示的ISaB1。10.根据权利要求6-9中任一项的整合子，特征在于其除包含蛋白质编码序列外，还包含保证由棒状杆菌转位的转位因子序列。11.根据权利要求6-10中任一项的整合子，特征在于这些转位因子序列缺少编码转位酶的序列。12.根据权利要求1-11中任一项的整合子，特征在于它包含一个有用的序列。13.根据权利要求12的整合子，特征在于所说的有用序列编码有用的肽或蛋白质。14.根据权利要求13的整合子，特征在于有用蛋白质是同源蛋白质。15.根据权利要求14的整合子，特征在于有用蛋白质是异源蛋白质。16.根据权利要求13-15中任一项的整合子，特征在于有用蛋白质是酶。17.根据权利要求16的整合子，特征在于编码有用蛋白质的序列选自下列基因-gltA，-gdhA。18.根据权利要求2-17中任一项的整合子，特征在于整合子中不存在的限制性位点选自-NotⅠ，-BstⅩⅠ。19.根据权利要求1-15中任一项的整合子，特征在于所说的序列适应于棒状细菌菌株。20.根据权利要求19的整合子，特征在于所说的序列在适应于棒状杆菌属之前被转移到短杆菌属菌株中。21.根据权利要求20的整合子，特征在于所说的序被扩增。22.根据权利要求21的扩增的整合子，特征在于扩增产生稳定整合的序列。23.根据权利要求1的整合子，特征在于它含有在乳酸发酵短杆菌中整合的栖糖蜜棒状杆菌的同源序列。24.利用权利要求1-23中任一项的整合子转化棒状细菌菌株的方法，特征在于经电穿孔将整合子引入所说的菌株中。25.可按权利要求24的方法制得的棒状细菌。26.根据权利要求25的棒状细菌，特征在于其涉及下列菌株-乳酸发酵短杆菌，-黄色短杆菌，-谷氨酸棒状杆菌，-栖糖蜜棒状杆菌。全文摘要本发明涉及棒状细菌的整合子，特征在于它包含确保在所说的棒状细菌中有效选择的基因及所说之棒状杆菌之基因组的同源序列，其中所说的序列适于所说的细菌。当所说的整合子含有编码有用蛋白质的序列时，其特别适于经培养由之转化的棒状细菌来生产蛋白质。文档编号C12N15/77GK1061624SQ9110886公开日1992年6月3日申请日期1991年8月8日优先权日1990年8月8日发明者A·盖杨瓦基,O·R·阿瓦尔多,J·拉巴瑞,C·博纳米,G·莱博恩申请人:国家科研中心