专利名称：棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
技术领域：
本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。
背景技术：
在全球变暖和化·石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。另外，也尚未获知利用基因重组菌生产苯酚且能够得到足以实用的苯酚生产率的技术。
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能够以糖类为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以糖类为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。(i)在棒状细菌中导入分支酸-丙酮酸裂解酶基因和4-羟基苯甲酸脱羧酶基因而得到的转化体能够高效地生产苯酚。
( )该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的4-羟基苯甲酸羟化酶基因被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。(iii)该转化体中，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶基因以比转化前的宿主基因的表达水平高的水平进行表达时，能够更高效地生产苯酚。(iv)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。
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第I项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4_轻基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏朽1檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)等朽1檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonasmediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产喊杆菌(Ralstonia eutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因或脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrif icans)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的基因、克氏柠檬酸杆菌来源的基因、产气肠杆菌来源的基因、阴沟肠杆菌来源的基因、霍氏肠杆菌来源的基因、阪崎肠杆菌来源的基因、大肠埃希氏菌来源的基因、弗格森埃希氏菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌来源的基因或菠萝泛菌来源的基因。第4项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA,(a)由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列构成的DNA ；(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。第5项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(c)或⑷的DNA，(c)由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列构成的DNA ；(d)在严格的条件下与由(C)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
第6项.如第1项 第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有4-轻基苯甲酸轻化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。第7项.如第1项 第6项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。第8项.如第1项 第7项中任一项所述的转化体，其中，编码具有DAHP合酶(3_deoxy-D-arabino-heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase, 3_ 脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶)活性的酶的基因在宿主棒状细菌内高表达。第9项.如第1项 第8项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。第10项.如第1项 第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌 R(FERM P-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第11项.如第1项 第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。第12项.如第1项 第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。第13项.如第1项 第5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869中高表达编码具有DAHP合酶活性的酶的基因的棒状细菌。第14 项.谷氨酸棒杆菌 PHE18(保藏编号:NITE BP-995)、PHEl1、PHE12、PHE13、PHE14, PHE15、PHE16、PHE17、PHE19-1、PHE19-2, PHE19-3、PHE19-4, PHE19-5, PHE19-6,PHE19-7、PHE19-8、PHE19-9, PHE19-10、PHE19-11、PHE19-12、PHE20-1、PHE20-2、PHE20-3、PHE20-4、PHE20-5、PHE20-6、PHE20-7、PHE20-8、PHE20-9、PHE20-10、PHE20-11、PHE20-12、PHE20-13 或 PHE20-14 的转化体。第15项.一种苯酚的制造方法，其中，包括:使第1项 第14项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤，和回收反应液中的苯酚的步骤。第16项.如第15项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。第17项.如第15项或第16项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。第18项.如第15项 第17项中任一项所述的苯酚的制造方法，其中，糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鹿糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。发明效果
通过使用本发明的转化体，能够由糖类以高效率制造苯酚。一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酹。
图1是实施例中使用的各种质粒的构建图。图2是实施例中使用的各种质粒的构建图。图3是实施例中使用的各种质粒的构建图。图4是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。图5是表示苯酚对棒状杆菌在还原条件下的糖消耗的影响的图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。(I)具有苯酚生产能力的转化体本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4_轻基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到的转化体。宿主棒状细菌为Bargey’ s Manual of Determinative Bacteriology (伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599(1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)> 产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、角军烧棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，从安全且苯酚生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) R 株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869 株、ATCC13058 株、ATCC13059 株、ATCC13060 株、ATCC13232 株、ATCC13286株、ATCC13287 株、ATCC13655 株、ATCC13745 株、ATCC13746 株、ATCC13761 株、ATCC14020株、ATCC31831 株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)等。其中，优选 R株(FERM P-18976)、ATCC13032 株、ATCC13869 株。另外,根据分子生物学的分类,黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium Iilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl, ff.et al., Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T, “Brevibacterium flavum”DSM20411， “Brevibacteriumlactofermentum，，DSM20412and DSM1412, and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.1nt J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963 (1987)]。旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872 株)等。作为节杆菌属菌，可以列举球·形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010 株、ATCC4336 株、ATCC21056 株、ATCC31250 株、ATCC31738 株、ATCC35698 株)等。作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210 株、ATCC27289 株)等。作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如 N0.239 株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus Ieuteus)(例如 N0.240 株(FERM P-13222))、服微球菌(Micrococcus ureae)(例如 IAM1010 株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如 IF03764 株)等。另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氧酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别是谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，W02005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)分支酸-丙酮酸裂解酶是催化使丙酮酸从分支酸酯/盐脱离而生成4-羟基苯甲酸酯/盐的反应的酶。编码具有分支酸-丙酮酸·裂解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter youngae)等朽1檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonasmediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产喊杆菌(Ralstonia eutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因和脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrif icans)来源的基因，更优选恶臭假单胞菌来源的基因。作为大肠埃希氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号31的碱基序列构成的DNA，作为恶臭假单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号34的碱基序列构成的DNA，作为鲍氏不动杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号81的碱基序列构成的DNA，作为维氏固氮菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号82的碱基序列构成的DNA，作为需盐色盐杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号83的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号84的碱基序列构成的DNA，作为杨氏柠檬酸杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号85的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号86的碱基序列构成的DNA，作为水油海杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号87的碱基序列构成的DNA，作为地中海海单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号88的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号89的碱基序列构成的DNA，作为游海假交替单胞菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号90的碱基序列构成的DNA，作为真氧产碱杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号91的碱基序列构成的DNA，作为腐败希瓦氏菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号92的碱基序列构成的DNA，作为脱氮硫杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因，可以列举由序列号93的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、·序列号92或序列号93的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2, pll.45中记载的条件。具体而言,是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5 10°C的温度下发生杂交的情况。分支酸-丙酮酸裂解酶活性可以利用《Journal of Bacteriology, 174，5309-5316，1992“Materials and Methods”》中记载的方法测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有50mM Tris-HCl pH7.5、5mM EDTA、IOmMβ -巯基乙醇、60 μ M分支酸和酶的反应液，测定240nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加分支酸的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为分支酸-丙酮酸裂解酶活性。另外，本发明中，也可以使用由与序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社七1、f ^ ^制造)算出的值。由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。4~轻基苯甲酸月兑豫酶基因(bsdBCD或dca)
4-羟基苯甲酸脱羧酶是催化通过4-羟基苯甲酸酯/盐的脱羧生成苯酚的反应的酶。编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)等芽孢杆菌属细菌来源的基因、克氏朽1樣酸杆菌(Citrobacter koseri·)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细菌来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)等埃希氏菌属细菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因等。其中，优选芽孢杆菌属细菌(特别是枯草芽孢杆菌)来源的基因、肠杆菌属细菌(特别是阴沟肠杆菌)来源的基因、埃希氏菌属细菌(特别是大肠埃希氏菌)来源的基因。另外，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因根据来源使用各种不同的简称。例如，枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因简称为bsdBCD。本说明书中，有时无论来源如何将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因均简称为“dca”。作为枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号37的碱基序列构成的DNA，作为萎缩芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号44的碱基序列构成的DNA，作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号47的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号50的碱基序列构成的DNA，作为产气肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号53的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号56的碱基序列构成的DNA，作为霍氏肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号59的碱基序列构成的DNA，作为阪崎肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号62的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号65的碱基序列构成的DNA，作为弗格森埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号68的碱基序列构成的DNA,作为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poIymyxa)来源的4_轻基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号71的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)来源的4_羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号74的碱基序列构成的DNA。另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。4_轻基苯甲酸脱竣酶活性可以利用《Genomics, 86, 342-351，2005^Materials andMethods”》中记载的方法测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有IOOmMMES, pH6.0、ImM DTT、5mM4_羟基苯甲酸酯/盐和酶的反应液，测定270nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加4-羟基苯甲酸酯/盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为4-羟基苯甲酸脱羧酶活性。另外，本发明中，也可以使用由与序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过前述的方法获得。用于转化的载体的构建将通过PCR扩增得到的编码分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA和编码4_羟基苯甲酸脱羧酶的DNA各自克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举:乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) 2256来源的 pAM330[日本特开昭 58-67699]、[Miwaj K.et al., Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi，R.et al.，Determination of the complete nucleotide sequenceof tthe Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis ofits genetic information.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267 (1985)]、谷氨酸棒杆菌 ATCC13058 来源的 pHM1519 [Miwa，K.et al., Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903 (1984)]和 pCRY30 [Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌 T250 来源的 pCG4[日本特开昭 57-183799]、[Katsumata, R.et al., Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311 (1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50 [日本特开昭 62-166890]、pEKO、pEC5、pEKExl [Eikmanns，B.J.etal., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning, controlled gene expression, and promoter probing.Gene, 102:93-98 (1991)]等
作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(IdhA)的启动子PldhA等,其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB TIT2终 止子。转化转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu, Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447 (1990)]和[Vertes A.A.etal., Presence of mrr-and mcr—like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。作为碳源，可以列举:葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨·糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1 约10 (w/v%)即可。作为氮源，可以列举:氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约5 约8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui, M.et al., Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT 培养基[Omumasaba, C.A.et al., Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite, ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。
培养温度设定为约15°C 约45°C即可，培养时间设定为约I天 约7天即可。宿主染色体基因的破坏或缺失宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因(pobA)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酹。另外，宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(PoxF)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。特别优选pobA和poxF这两者均被破坏或发生缺失。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到4-羟基苯甲酸羟化酶基因(pobA)被破坏或发生缺失的棒状细菌。另外，通过同样的方法，能够得到苯酚2-单加氧酶基因(poxF)被破坏或·发生缺失的棒状细菌。代谢基因的1 表达本发明的转化体中，优选DAHP 合酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase)基因(aroG)以比宿主本来的水平、即野生型宿主的水平高的水平进行表达。该高表达通过利用转化导入基因或增加宿主染色体上的基因的拷贝数来实现。对转化进行说明，导入的DAHP合酶基因可以是与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合酶基因，也可以是其他的DAHP合酶基因。优选导入与宿主的基因相同或实质上相同的DAHP合酶基因。例如，作为谷氨酸棒杆菌来源的DAHP合酶基因，可以列举由序列号28的碱基序列构成的DNA。作为其他的棒状细菌的DHAP合酶基因，有:有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)来源的基因(序列号120，日本DNA数据库:CE2073)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的基因(序列号 121,日本 DNA 数据库:MSMEG_4244)、混池红球菌(Rhodococcus opacus)来源的基因(序列号122,日本DNA数据库:R0P_08400)
坐寸ο另外，关于DAHP合酶基因，作为“实质上相同的基因”，可以列举编码与该基因所编码的多肽的氨基酸序列具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且具有DAHP合酶活性的多肽的DNA。另外，关于DAHP合酶基因，作为“实质上相同的基因”，可以列举与该基因具有90%以上的同一性、优选具有95%以上的同一性、更优选具有98%以上的同一性且编码具有DAHP合酶活性的多肽的DNA。DAHP合酶活性的有无可以通过以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藻糖-4-磷酸为底物进行反应并利用使用硫代巴比妥酸的显色法对生成的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)进行定量(Appl.Environ.Microbiol., 74:5497-5503 (2008).)来检测。对提高宿主染色体上的DAHP合酶基因的拷贝数的方法进行说明，只要以多拷贝在谷氨酸棒杆菌的染色体DNA上导入该基因即可。为了在微生物的染色体DNA上以多拷贝导入基因，可以利用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为标靶，并利用同源重组法(Experiments in Molecular Genetics (分子遗传学实验)，冷泉港实验室(1972))进行。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以利用重复DNA、存在于转移因子的端部的反向重复序列。另外，也可以如日本特开平2-109985号公报中公开的那样，使目的基因与转座子一同发生转移而以多拷贝导入到染色体DNA上。此外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(日本特开平2-109985号)将目的基因重组到宿主染色体中。
另外，也可以通过将棒状细菌的染色体上的DAHP合酶基因的启动子等表达调节序列转换成更强的表达调节序列来提高这些基因的表达。例如，作为强启动子，已知tac启动子、Iac启动子、trc启动子、trp启动子等。另外，也可以如国际公开W000/18935中公开的那样，向基因的启动子区导入数个碱基的碱基置换而将其改变成更强的启动子。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载在Goldstein等人的论文(Prokaryotic promotersin biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev., 1995, I, 105-128)等中。表达调节序列的置换例如可以与使用温度敏感性质粒的基因置换同样地进行。此外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区、特别是紧靠起始密码子的上游的序列中的数个核苷酸的置换会给mRNA的翻译效率带来非常大的影响，通过改变这些序列，也能够提高翻译量。作为进行上·述基因置换的方法，例如有:使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号说明书或日本特开平05-007491号公报)。(II)苯酷的制造方法可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有糖类的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。微牛物的增葙在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25°C 约38°C的温度下培养约12小时 约48小时而使其增殖。反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，也可以使用:糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等);甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约I (w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui，M.etal.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate andsuccinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004) ]、BT 培养基[Omumasaba，C.A.etal.，Corynebacteriumglutami cum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms withopposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液作为反应液，可·以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，使用糖类。作为糖类，可以列举:葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，优选单糖，更优选葡萄糖。作为碳源，除了可以使用糖类以外，也可以使用:甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。反应液中的糖类的浓度优选约I 约20 (w/v%),更优选约2 约10 (w/v%),进一步优选约2 约5 (w/v%)。另外，包括糖类在内的全部碳源在反应液中的浓度通常设定为约2 约5(w/v%)即可。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01 约l(w/v%)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在反应液中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1 约10(w/v%)即可。还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6 约8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举前述的A培养基、BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应条件
反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20°C 约50°C，更优选约25V 约40°C。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。另外，反应时间优选约I天 约7天，更优选约I天 约3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。<还原备件>反应可以在·需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。优选在还原条件下进行。在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV 约-500mV，更优选约_250mV 约_500mV。反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig, Net.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, AHandbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed.by Starr, M.P.et.al.p.926-940, Berlin, Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约IOmmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸懼水等处理约I分钟 约60分钟、优选约5分钟 约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的PH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。苯酚的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。实施例实施例1苯酚牛产基因的克降和表汰
(I)从微牛物中提取染色体DNA从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum) R(FERM P-18976)中提取染色体 DNA 的操作如下进行:向 A 培养基[将(NH2) 2C02g、(NH4) 2S047g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H20+0.042% (w/v) MnSO4.2H201ml、0.02%(w/v)生物素溶液lml、0.01% (w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于IL蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用钼环接种后，在33°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从大肠埃希氏菌(Escherichia coli K-12MG1655)中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida KT2440) ATCC47054 中提取染色体 DNA 的操作如下进行:使用钼环接种到LB培养基[将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii) JCM6841中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到JCM Medium N0.12培养基[将蛋白胨5g、牛肉提取物3g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)ATCC9104中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.805培养基[将酵母提取物lg、甘露糖醇5g、K2HPO40.7g、KH2PO40.lg、MgSO4.7Η200.2g、NaCllg 溶解于 IL 蒸馏水中]中后，在 30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体 DNA。从需盐色盐杆菌(Chromohalobactersalexigens)ATCC BAA-138 中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到含NaCl的营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g、NaCllOOg溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从杨氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter youngae) ATCC29220中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)ATCC700491 的染色体 DNA (目录号700491D-5)由 ATCC (American Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从地中海海单胞菌(Marinomonasmediterranea)NBRC103028 中提取染色体 DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.340培养基[将海生菌肉汤2216 (BD公司制造，目录号279110) 37.4g溶解于IL蒸馏水中]中后，在25°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按·照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)NBRC102225 中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.340培养基[将海生菌肉汤2216 (BD公司制造，目录号279110)37.4g溶解于IL蒸馏水中]中后，在25°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha) IAM12368中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000) 8g溶解于IL蒸馏水中]中后，在26°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens) JCM20190中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到营养肉汤培养基[将营养肉汤(BD公司制造，目录号234000)8g溶解于IL蒸馏水中]中后，在25°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrif icans) ATCC25259JCM20190 中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到JCM Medium N0.91培养基[将KN035g、NaHCO30.5g溶解于 IL S6 培养基(将 KH2PO4L 8g、Na2HPO4L 2g、(NH4)2SO40.lg、MgSO4.7Η200.lg、FeCl3.6H2030mg、MnSO4.xH2030mg、CaCl2.2H2040mgU0%Na2S203 溶液 IOOml 溶解于 900ml蒸馏水中)]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织·DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) JCM9070中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到JCM Medium N0.22培养基[将蛋白胨10g、牛肉提取物10g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名:GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从枯草芽抱杆菌斯氏亚种(Bacillussubtilis subsp.spizizenii)NBRClO1239中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。克氏朽1樣酸杆菌(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895的染色体DNA(目录号BAA-895D-5)从 ATCC(American Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在3·7°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在37°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)ATCC49162中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到胰酪胨大豆肉汤培养基[将胰酪胨大豆肉汤(BD公司制造，目录号211825) 30g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)ATCC BAA-894 的染色体 DNA(目录号BAA-894D-5)从 ATCC (American Type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)获得。从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ff NBRC13500中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名=GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒,安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名AenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBRC15309中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到NBRC Medium N0.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgS04.7H201g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从菠萝泛菌(Pantoea ananatis) LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行:使用钼环接种到BCCM/LMG BacteriCulture Medium N0.1培养基[将牛肉提取物lg、酵母提取物2g、蛋白胨5g、NaC15g溶解于IL蒸馏水中]中后，在30°C下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名KenomicPr印细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。(2)克隆载:体的构建克降载体DCRB22的构律通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCMl2072来源的质粒pCASEl的DNA复制起点(以下记作pCASEl-ori)序列和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号I (pCASEl-ori序列)、序列号2 (克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。pCASEl-ori序列扩增用引物(a-1):5，-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3 (序列号 3)(b-Ι):5’ -AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号 4)另外，引物(a-Ι)和(b-Ι)上附加有BglII限制性内切酶位点。克隆载体pHSG298扩增用引物(a-2):5’ -AT AGATCT AGGITTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号 5)(b-2):5，-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号 6)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液: TaKaRa LA Taq 旧(5 1 丫1 R/μΙ) 0.5μΙ
lOxLAPCR 缓冲液ΙΙ(无 Mg2+) 5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混合物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΒΝΑ含量Ipg以下)
上述记载的两种引物各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1
将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增pCASEl-ori序列时使用引物(a_l)与(b_l)的组合进行，扩增克隆载体PHSG298时使用引物(a-2)与(b_2)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°CpCASEl-ori 序列 150 秒克隆载体pHSG298 180 秒将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在pCASEl-ori序列的情况下检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下检测到约2.7_kb的DNA片段。将由上述PCR扩增出的包含乳酪棒杆菌株来源的质粒pCASE 1-or i序列的约1.4-kb的DNA片段10 μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7_kb的DNA片段10 μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1 μlI T4DNA连接酶IOX缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。利用氯化钙法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PHSG298的约2.7_kb的DNA片段以外，还确认到pCASE_ori序列的约1.4-kb的DNA片段。将包含pCASEl-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。克降载体DCRBll的构律通过以下的PCR法对分别包含能够在谷氨酸棒杆菌内进行复制的质粒pCGl[(日本特开昭57-134500)]来源的DNA复制起点(以下记作pCGl_ori)序列和克隆载体PHSG398 (宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将pCGl-ori序列、克隆载体pHSG398克隆化，基于序列号7 (pCGl-ori序列)、序列号8(克隆载体pHSG398)分别合成下述一对引物来使用。pCGl-ori序列扩增用引物(a-3):5，-AT AGATCT AGCATGGTCGTCACAGAG-3’(序列号 9)(b-3):5，-AT AGATCT GGAACCGTTATCTGCCTATG-3’(序列号 10)另外，引物(a-3)和(b-3)上附加有BglII限制性内切酶位点。克隆载体pHSG398扩增用引物(a-4):5’ -AT AGATCT GTCGAACGGAAGATCACTTC-3’(序列号 11)(b-4):5’ -AT AGATCT AGTTCCACTGAGCGTCAG-3’(序列号 12)
另外，引物(a-4)和(b_4)上附加有BglII限制性内切酶位点。模板DNA使用pCGl [(日本特开昭57-134500)]和克隆载体pHSG398 (宝生物株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
TaKaRa LA Taq (5 Φ.位/μ )0.5μ1
IOxLA PCR 缓冲液II(无 Mg2+)5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混合物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量bg以下)
上述记载的两种引物’各0.5μ1(终浓度ΙμΜ.)
无菌蒸馏水25.5μ1
将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增pCGl-ori序列时使用引物(a_3)与(b_3)的组合进行，扩增克隆载体PHSG398时使用引物(a-4)与(b_4)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°CpCGl-ori 序列 120 秒克隆载体pHSG398 150 秒将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在pCGl-ori序列的情况下检测到约1.9-kb的DNA片段，在克隆载体PHSG398的情况下检测到约2.2_kb的DNA片段。将由上述PCR扩增出的包含质粒pCGl来源的pCGl_ori基因的约1.9-kb的DNA片段10 μ 1和包含克隆载体PHSG398的约2.2_kb的DNA片段10 μ I分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1 μ 1 T4DNA连接酶10 X缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸 馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。利用氯化1丐法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PHSG398的约2.2_kb的DNA片段以外，还确认到pCGl-ori序列的约1.9-kb的DNA片段。将包含pCGl-ori序列的克隆载体命名为pCRBll。克降载体dCRBI5的构律通过以下的PCR法对包含克隆载体pCRBll的DNA片段和pSELECT-zeo-mcs (英杰株式会社制造)来源的博莱霉素耐性基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将克隆载体pCRBll和博莱霉素耐性基因克隆化，基于序列号13 (pCRBll)和序列号14(博莱霉素耐性基因)分别合成下述一对引物来使用。克隆载体pCRBll序列扩增用引物(a-5):5，-AT GATATC CGAAGTGATCTTCCGTTCGA-3’(序列号 15)(b-5):5，-AT GATATC AAGGCAGTTATTGGTGCCCT-3’(序列号 16)另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有EcoRV限制性内切酶位点。 博莱霉素耐性基因扩增用弓丨物(a-6):5’ -AT GATATC TAGCTTATCCTCAGTCCTGC-3’(序列号 17)(b-6):5’ -AT GATATC CCATCCACGCTGTTTTGACA-3’(序列号 18)另外，引物(a-6)和(b_6)上附加有EcoRV限制性内切酶位点。
模板DNA使用克隆载体pCRBll和pSELECT-zeoncs (英杰株式会社制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
TaKaRa LA T叫 (5 Φ.Κ/μΙ)O ^μ1
IOxLA PCR 缓冲液II(无 Mg2+)5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混合物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量I以下)
上述记载的两种引物Φ)各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增克隆载体pCRBll序列时使用引物(a-5)与(b_5)的组合进行，扩增博莱霉素耐性基因时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°CpCRBll 序列200 秒博莱霉素耐性基因45秒将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在克隆载体pCRBll序列的情况下检测到约3.3-kb的DNA片段，在博莱霉素耐性基因的情况下检测到约0.5-kb 的 DNA 片段。将由上述PCR扩增出的包含克隆载体pCRBll的约3.3-kb的DNA片段10 μ I和包含pSELECT-zeo-mcs质粒来源的博莱霉素耐性基因的约0.5-kb的DNA片段10 μ I分别用限制性内切酶EcoRV进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶IOX缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。利用氯化 丐法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有25 μ g/ml博莱霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶EcoRV分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRBll来源的约3.3-kb的DNA片段以外，在博莱霉素耐性基因的情况下，还确认到约0.5-kb 的 DNA 片段。将包含博莱霉素耐性基因的克隆载体命名为pCRB15。克降载体DCRB207的构律通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的 gapA 基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段和包含克隆载体pKK223_3 (法玛西亚公司制造)来源的rrnBTlT2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号19(PgapA序列)、序列号20 (终止子序列)分别合成下述一对引物来使用PgapA序列扩增用引物(a-7):5’ -CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(序列号 21)(b-7):5，-CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3，(序列号22)另外，引物(a-7)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-7)上附加有Sail、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。终止子序列扩增用引物(a-8):5，-CTCT GCATGC CCATGG CTGITTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号 23)(b-8):5，-CTCT GCATGC TCATGA AAGAGITTGTAGAAACGCAAAAAGG-3 (序列号 24)另外，引物(a-8)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b_8)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R (FERM P-18976)的染色体DNA和pKK223_3质粒(法玛西亚公司制造)。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液:
TaKaRa LA Taq (5 Φ.位/μ )0.5μ1
IOxLA PCRtm 缓冲液ΙΙ(无 Mg2+)5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混介物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量Ipg以下)·
上述记载的两种引物各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增PgapA序列时使用引物(a_7)与(b_7)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°CPgapA 序列45 秒终止子序列30秒将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下检测到约0.4-kb的DNA片段。将由上述PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌R来源的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10 μ I和克隆载体PCRB22的约4.l_kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶IOX缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10 μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。利用氯化I丐法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。将由上述PCR扩增出的包含PKK223-3质粒来源的终止子序列的约0.4-kb的DNA片段10 μ I用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割，将上述的克隆载体pCRB2062 μ I用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶10Χ缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接E液。利用氯化I丐法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接E液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确·认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。将包含rrnBTlT2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207。克降载体DCRB209的构律通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的gapA (glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase A,甘油醒 _3_ 憐酸脱氧酶 A)基因的启动子(以下记作PgapA)序列的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将pCRB207序列克隆化，基于序列号25 (pCRB207)分别合成下述一对引物来使用。PCRB207序列扩增用引物(a-9):5，-CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’(序列号 26)(b-9):5’ -CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号 27)另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性内切酶位点。模板DNA使用含有gapA启动子和rrnBTlT2终止子序列的克隆载体pCRB207。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝酒造株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
TaKaRa LA Taqi μ(5 Φ-位/μ )0.5μ1
IOxLA PCR 缓冲液II(无 Mg2+)5μ1
25inM MgCl25μ1
dNTP 浞介物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量Ipg以下)
上述记载的两种引物I各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增pCRB207序列时使用引物(a_9)与(b_9)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°C 307秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含克隆载体PCRB207序列的约5.1-kb的DNA片段。将由上述PCR扩增出的包含pCRB207来源基因的约5.1-kb的DNA片段10 μ I用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，向其中添加I μ I T4DNA连接·酶10 X缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接F液。利用氯化I丐法[Journalof Molecular Biology, 53, 159(1970)]以所得到的连接F液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NdeI对该质粒进行切割，确认了限制性内切酶位点的插入。将包含PgapA序列和rrnBTlT2终止子序列的克隆载体命名为pCRB209。(3)苯酚生产基因的克隆(3-1) DAHP 合酶某闵(aroG)谷氨酸棒杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含谷氨酸棒杆菌来源的编码DAHP合酶的aroG基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将aroG基因克隆化，基于序列号28 (谷氨酸棒杆菌aroG基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。aroG基因扩增用引物(a-10):5，-CTCT CATATG AATAGGGGTGTGAGTTGG-3’(序列号 29)(b-10):5，-CTCT CATATG TTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG-3’(序列号 30)另外，引物(a-10)和(b_10)上附加有NdeI限制性内切酶位点。(3-2)分支酸-丙酮酸裂解酶基因(UbiC)大肠埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的UbiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号31 (大肠埃希氏菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制 造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-11):5，-CTCT CATATG TCACACCCCGCGTTAA-3’(序列号 32)(b-11):5，-CTCT CATATG TTAGTACAACGGTGACGCC-3’(序列号 33)另外，引物(a-11)和(b_ll)上附加有NdeI限制性内切酶位点。恶臭假单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含恶臭假单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的UbiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号34 (恶臭假单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
ubiC基因扩增用引物(a-12):5，-CTCT CATATG TCGTACGAATCCCCG-3’(序列号 35)(b-12):5，-CTCT CATATG TCAGCGGTTTTCCTCCTTG-3’(序列号 36)另外，引物(a-12)和(b_12)上附加有NdeI限制性内切酶位点。鲍氏不动杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法 对包含鲍氏不动杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号81 (鲍氏不动杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-29):5，-CTCT CATATG CGTAAACGACAACCAGTAC-3，(序列号 94)(b-29):5，-CTCT CATATG TCATAGTAATTCCTTGTCGTGCTG-3，(序列号 95)另外，引物(a-29)和(b_29)上附加有NdeI限制性内切酶位点。维氏固氮菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含维氏固氮菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号82 (维氏固氮菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-30):5，-CTCT CATATG ACCGCTGCTCCCG-3’(序列号 96)(b-30):5，-CTCT CATATG TTATAGGGTGTCCGGGTC-3’(序列号 97)另外，引物(a-30)和(b_30)上附加有NdeI限制性内切酶位点。需盐.色盐.杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含需盐色盐杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号83 (需盐色盐杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-31):5，-CTCT CATATG TCTCCTGACCGCTTC-3’(序列号 98)(b-31):5，-CTCT CATATG TTAGCGCGATGGCAGCG-3’(序列号 99)另外，引物(a-31)和(b-31)上附加有NdeI限制性内切酶位点。克氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含克氏柠檬酸杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的UbiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号84 (克氏柠檬酸杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。ubiC基因扩增用引物(a-32):5，-CTCT CATATG TCACACCCTGCGTTAAC-3，(序列号 100)(b-32):5，-CTCT CATATG TTAATACAACGGTGATGCGGG-3’(序列号 101)
另外，引物(a-32)和(b_32)上附加有NdeI限制性内切酶位点。杨氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含杨氏柠檬酸杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时,为了将ubiC基因克隆化,基于序列号85 (杨氏朽1檬酸杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-33):5，-CTCT CATATG CCACACCCTGCGTTAA-3’(序列号 102)(b-33):5，-CTCT CATATG TCAGTACAACGGCGATGCA-3’(序列号 103)另外，引物(a-33)和(b_33)上附加有NdeI限制性内切酶位点。阴沟肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号86 (阴沟肠杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-34):5，-CTCT CATATG TCACACCCTGCGCTAA-3’(序列号 104)(b-34):5，-CTCT CATATG TCAGTACAACGGCGATGC-3，(序列号 105)另外，引物(a-34)和(b_34)上附加有NdeI限制性内切酶位点。水油海杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含水油海杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号87 (水油海杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-35):5，-CTCT CATATG CCGTTAAAGGACTGTGAC-3，(序列号 106)(b-35):5’ -CTCT CATATG TTAACCCCGGTTGGGC-3’(序列号 107)另外，引物(a-35)和(b_35)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
_2] 地中海海单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含地中海海单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号88 (地中海海单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。ubiC基因扩增用引物(a-36):5，-CTCT CATATG ACGTTACTCAATAAAAACGCTG-3，(序列号 108)(b-36):5’ -CTCT CATATG CTACAGCTGGCCTATGGTA-3’(序列号 109)另外，引物(a-36)和(b_36)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
_9] 菠萝泛菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对 包含菠萝泛菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号89 (菠萝泛菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-37):5，-CTCT CATATG ACGCAAGACCCGCT-3’(序列号 110)(b-37):5’ -CTCT CATATG TTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3’(序列号 111)另外，引物(a-37)和(b_37)上附加有NdeI限制性内切酶位点。游海假交替单胞菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含游海假交替单胞菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号90 (游海假交替单胞菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-38):5，-CTCT CATATG ATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC-3，(序列号 112)(b-38):5’ -CTCT CATATG TCATGAGTACAAATACGCTCCTG-3’(序列号 113)另外，引物(a-38)和(b_38)上附加有NdeI限制性内切酶位点。真氧产碱杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含真氧产碱杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的UbiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将UbiC基因克隆化，基于序列号91 (真氧产碱杆菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-39):5’ -CTCT CATATG AGCGCGCAGTCCG-3’(序列号 114)(b-39):5，-CTCT CATATG TCATCTCGTGGTCTCTTTCTTG-3，(序列号 115)另外，引物(a-39)和(b_39)上附加有NdeI限制性内切酶位点。腐败希瓦氏菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含腐败希瓦氏菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将ubiC基因克隆化，基于序列号92 (腐败希瓦氏菌ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。UbiC基因扩增用引物(a-40):5，-CTCT CATATG AATGTGACTAGCTTAAGCTTCC-3，(序列号 116)(b-40):5，-CTCT CATATG TCACTGGCAAATTGCTCGC-3，(序列号 117)另外，引物(a-40)和(b_40)上附加有NdeI限制性内切酶位点。脱氮硫杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含脱氮硫杆菌来源的编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的基因的ubiC基因的DNA片段进行扩增。PCR时， 为了将ubiC基因克隆化，基于序列号93 (脱氣硫杆囷ubiC基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
ubiC基因扩增用引物(a-41):5，-CTCT CATATG ATCGCCACGCGCG-3’(序列号 118)(b-41):5’ -CTCT CATATG TCATGGCGTTAATAGGGCG-3’(序列号 119)另外，引物(a-41)和(b_41)上附加有NdeI限制性内切酶位点。(3-3)4-羊子基苯甲酸月兑豫酶基因(bsdBCD/dca)枯草芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法 对包含枯草芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的bsdBCD基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将bsdB⑶基因克隆化，基于序列号37 (枯草芽孢杆菌bsdB⑶基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。bsdBCD基因扩增用引物(a-13):5，-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3，(序列号 38)(b-13):5，-CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG-3’(序列号 39)另外，引物(a-13)和(b-13)上附加有NdeI限制性内切酶位点。萎缩芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含萎缩芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号44 (萎缩芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-16):5，-CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG-3’(序列号 45)(b-16):5’ -CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC-3’(序列号 46)另外，引物(a-16)和(b_16)上附加有NdeI限制性内切酶位点。枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号47 (枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-17):5’ -CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3 (序列号 48)(b-17):5’ -CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG-3’(序列号 49)另外，引物(a-17)和(b_17)上附加有NdeI限制性内切酶位点。克氏柠檬酸杆菌来源·的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含克氏柠檬酸杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时,为了将dca基因克隆化，基于序列号50 (克氏朽1檬酸杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-18):5，-CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG-3’(序列号 51)
(b-18):5’ -CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG-3’(序列号 52)另外，引物(a-18)和(b_18)上附加有NdeI限制性内切酶位点。产气肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含产气肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号53 (产气肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-19):5’ -CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG-3’(序列号 54)(b-19):5’ -CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC-3’(序列号 55)另外，引物(a-19)和(b_19)上附加有NdeI限制性内切酶位点。阴沟肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号56 (阴沟肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-20):5，-CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC-3，(序列号 57)(b-20):5，-CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG-3’(序列号 58)另外，引物(a-20)和(b_20)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
_7] 霍氏肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含霍氏肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号59 (霍氏肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-21):5，-CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC-3，(序列号 60)(b-21):5，-CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC-3’(序列号 61)另外，引物(a-21)和(b_21)上附加有NdeI限制性内切酶位点。阪崎肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含阪崎肠杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号62 (阪崎肠杆囷dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用 引物(a-22):5，-CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC-3，(序列号 63)(b-22):5，-CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC-3’(序列号 64)另外，引物(a-22)和(b_22)上附加有NdeI限制性内切酶位点。大肠埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号65 (大肠埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-23):5，-CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG-3’(序列号 66)(b-23):5，-CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC-3，(序列号 67)另外，引物(a-23)和(b_23)上附加有NdeI限制性内切酶位点。弗格森埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含弗格森埃希氏菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号68 (弗格森埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-24):5，-CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT-3，(序列号 69)(b-24):5，-CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC-3，(序列号 70)另外，引物(a-24)和(b_24)上附加有NdeI限制性内切酶位点。多粘类芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含多粘类芽孢杆菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号71 (多粘类芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-25):5，-CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG-3’(序列号 72)(b-25):5，-CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG-3’(序列号 73)另外，引物(a-25)和(b_25)上附加有NdeI限制性内切酶位点。菠萝泛菌来源的苯酚生产基因的克隆通过以下的PCR法对包含菠萝泛菌来源的编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号74 (菠萝泛菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。dca基因扩增用引物(a-26):5，-CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC-3 (序列号 75)(b-26):5’ -CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG-3’(序列号 76)另外，引物(a-26)和(b_26)上附加有NdeI限制性内切酶位点。(3-4)备件对于模板DNA而言， 谷氨酸棒杆菌使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。大肠埃希氏菌使用提取自大肠埃希氏菌K12MG1655的染色体DNA。恶臭假单胞菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的恶臭假单胞菌ATCC47054的染色体DNA。鲍氏不动杆菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的鲍氏不动杆菌JCM6841的染色体DNA。维氏固氮菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的维氏固氮菌ATCC9104的染色体DNA。需盐色盐杆菌使用提取自由·美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的需盐色盐杆菌ATCC BAA-138的染色体DNA。杨氏朽1檬酸杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的杨氏朽1檬酸杆菌ATCC29220的染色体DNA。水油海杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的水油海杆菌染色体DNA (目录号 700491D-5)。地中海海单胞菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的地中海海单胞菌NBRC103028 的染色体 DNA。游海假交替单胞菌使用提取自由NITE (National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的游海假交替单胞菌NBRC102225 的染色体 DNA。真氧产碱杆菌使用由应用微生物研究所培养物保藏中心(IAM)获得的真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha) IAM12368 的染色体 DNA。腐败希瓦氏菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的腐败希瓦氏菌JCM20190的染色体DNA。脱氮硫杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的脱氮硫杆菌ATCC25259 的染色体 DNA。枯草芽抱杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌NBRC14144 的染色体 DNA。萎缩芽孢杆菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的萎缩芽孢杆菌JCM9070的染色体DNA。枯草芽抱杆菌斯氏亚种使用提取自由NITE (National Institute of Technologyand Evaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌斯氏亚种NBRC101239的染色体DNA。克氏朽1檬酸杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的克氏朽1檬酸杆菌染色体DNA (目录号BAA-895D-5)。产气肠杆菌使用提取自由NITE (National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的产气肠杆菌NBRC13534 的染色体 DNA。阴沟肠杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的阴沟肠杆菌NBRC13535 的染色体 DNA。
霍氏肠杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的霍氏肠杆菌ATCC49162 的染色体 DNA。阪崎肠杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的阪崎肠杆菌染色体DNA (目录号 BAA-894D-5)。大肠埃希氏菌W 使用提取自由 NITE (National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的大肠埃希氏菌NBRC13500 的染色体 DNA。弗格森埃希氏菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的弗格森埃希氏菌NBRC102419 的染色体 DNA。多粘类芽抱杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation,日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的多粘类芽孢杆菌NBRC15309 的染色体 DNA。菠萝泛菌使用提取自由BCCM/LMG(比利时微生物协作保藏中心/微生物实验室，根特大学)获得的菠萝泛菌LMG20103的染色体DNA。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液: TaKaRa LA Taq1M(5 ψ. ^/μ1)0.5μΙ
IOxLA PCR 缓冲液II(无 Mg2+)5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混合物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量Ipg以下)
上述记载的两种引物 各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增谷氨酸棒杆菌aroG基因时使用引物(a_10)与(b_10)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌UbiC基因时使用引物(a-11)与(b-11)的组合进行，扩增恶臭假单胞菌ubiC基因时使用引物(a-12)与(b-12)的组合进行，扩增鲍氏不动杆菌ubiC基因时使用引物(a-29)与(b-29)的组合进行，扩增维氏固氮菌ubiC基因时使用引物(a_30)与(b_30)的组合进行，扩增需盐色盐杆菌ubiC基因时使用引物(a-31)与(b-31)的组合进行，扩增克氏朽1檬酸杆菌ubiC基因时使用引物(a-32)与(b_32)的组合进行,扩增杨氏朽1檬酸杆菌ubiC基因时使用引物(a-33)与(b-33)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌ubiC基因时使用引物(a-34)与(b-34)的组合进行，扩增水油海杆菌ubiC基因时使用引物(a_35)与(b_35)的组合进行，扩增地中海海单胞菌ubiC基因时使用引物(a-36)与(b-36)的组合进行，扩增菠萝泛菌ubiC基因时使用引物(a-37)与(b-37)的组合进行，扩增游海假交替单胞菌ubiC基因时使用引物(a-38)与(b-38)的组合进行，扩增真氧产碱杆菌ubiC基因时使用引物(a-39)与(b-39)的组合进行，扩增腐败希瓦氏菌ubiC基因时使用引物(a_40)与(b_40)的组合进行，扩增脱氮硫杆菌ubiC基因时使用引物(a-41)与(b-41)的组合进行，扩增枯草芽孢杆菌bsdBCD基因时使用引物(a-13)与(b_13)的组合进行，扩增萎缩芽孢杆菌dca基因时使用引物(a-16)与(b-16)的组合进行，扩增枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因时使用引物(a-17)与(b-17)的组合进行，扩增克氏柠檬酸杆菌dca基因时使用引物(a_18)与(b-18)的组合进行，扩增产气肠杆菌dca基因时使用引物(a-19)与(b_19)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌dca基因时使用引物(a-20)与(b_20)的组合进行，扩增霍氏肠杆菌dca基因时使用引物(a-21)与(b-21)的组合进行，扩增阪崎肠杆菌dca基因时使用引物(a_22)与(b-22)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌W dca基因时使用引物(a-23)与(b_23)的组合进行，扩增弗格森埃希氏菌dca基因时使用引物(a-24)与(b_24)的组合进行，扩增多粘类芽孢杆菌dca基因时使用引物·(a-25)与(b_25)的组合进行，扩增菠萝泛菌dca基因时使用引物(a-26)与(b-26)的组合进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°C
谷氨酸棒杆菌aroG基因84秒
大肠埃希氏菌ubiC基因30秒
恶臭假单胞Sf ubiC基因33秒
鲍氏不动杆菌ubiC基因31秒
维氏固氮菌ubiC基因33秒
需盐色盐杆菌ubiC基因33秒
克氏梓檬酸杆菌ubiC基因30秒
杨氏梓檬酸杆菌ubiC基因30秒
阴沟肠杆菌ubiC基因30秒
水油海杆菌ubiC基因34秒地中海海单胞菌ubiC基因32秒
菠萝泛菌ubiC基因31秒
游海假交替单胞菌ubiC基因 33秒真氧产碱杆菌ubiC基因40秒
腐败希瓦氏菌ubiC基因34秒
脱氣硫杆囷ubiC基因34秒
枯草芽孢杆菌bsdBCD基因137秒
萎缩芽孢杆菌dca基因135秒
枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因137秒克氏柠檬酸杆菌dca基因136秒
产气肠杆菌dca基因136秒
阴沟肠杆菌dca基因135秒
霍氏肠杆菌dca基因141秒
阪崎肠杆菌dca基因137秒
大肠埃希氏菌W dca基因136秒
弗格森埃希氏菌dca基因136秒
多粘类芽孢杆菌dca基因138秒
菠萝泛菌dca基因139秒·将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌aroG基因的情况下能够检测到约1.4-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在恶臭假单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约
0.6-kb的DNA片段，在鲍氏不动杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在维氏固氮菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在需盐色盐杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在克氏柠檬酸杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在杨氏柠檬酸杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约
0.5-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在水油海杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在地中海海单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在菠萝泛菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在游海假交替单胞菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在真氧产碱杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.7-kb的DNA片段，在腐败希瓦氏菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在脱氮硫杆菌ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在枯草芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在萎缩芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3_kb的DNA片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在克氏朽1檬酸杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段,在产气肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在霍氏肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.4-kb的DNA片段，在阪崎肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段,在大肠埃希氏菌W dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在弗格森埃希氏菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在多粘类芽孢杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在菠萝泛菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段。(4)苯酷生产基因表达质粒的构建苯酚牛产某闵向DCRB209中的克降将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的约1.4-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的约0.7-kb的DNA片段、包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的约
0.6-kb的DNA片段、包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的约2.3-kb的DNA片段、包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含产气肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的约2.4-kb的DNA片段、包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含菠萝泛菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段各10 μ I以及含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2092 μ I分别用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶IOX缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其分别作为连接G液、连接H液、连接I液、连接AA液、连接AB液、连接AC液、连接AD液、连接AE液、连接AF液、连接AG液、连接AH液、连接Al液、连接AJ液、连接AK液、连接AL液、连接AM液、连接J液、连接O液、连接P液、连接Q液、连接R液、连接S液、连接T液、连接U液、连接V液、连接W液、连接X液和连接Y液。利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]以所得到的 28种连接G液、连接H液、连接I液、连接AA液、连接AB液、连接AC液、连接AD液、连接AE液、连接AF液、连接AG液、连接AH液、连接Al液、连接AJ液、连接AK液、连接AL液、连接AM液、连接J液、连接O液、连接P液、连接Q液、连接R液、连接S液、连接T液、连接U液、连接V液、连接W液、连接X液和连接Y液分别转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。 通过常规方法对各培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒PCRB209的约5.Ι-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因(连接G液)的情况下，还确认到长度为约1.4-kb的插入·片段，在大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因(连接H液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因(连接I液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因(连接AA液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在维氏固氮菌株来源的ubiC基因(连接AB液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因(连接AC液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AD液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AE液)的情况下，还确认到长度为约
0.5-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因(连接AF液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在水油海杆菌株来源的ubiC基因(连接AG液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在地中海海单胞菌株来源的ubiC基因(连接AH液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的ubiC基因(连接Al液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因(连接AJ液)的情况下，还确认到长度为约0.5-kb的插入片段，在真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因(连接AK液)的情况下，还确认到长度为约0.7-kb的插入片段，在腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因(连接AL液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因(连接AM液)的情况下，还确认到长度为约0.6-kb的插入片段，在枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因(连接J液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因(连接O液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因(连接P液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因(连接Q液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在产气肠杆菌株来源的dca基因(连接R液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的dca基因(连接S液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在霍氏肠杆菌株来源的dca基因(连接T液)的情况下，还确认到长度为约2.4-kb的插入片段，在阪崎肠杆菌株来源的dca基因(连接U液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌W株来源的dca基因(连接V液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在弗格森埃希氏菌株来源的dca基因(连接W液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因(连接X液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的dca基因(连接Y液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段。将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒命名为pCRB209_aroG/CG，将包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/EC，将包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/PP，将包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/ACB，将包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/AVN，将包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209_ubiC/CSA，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/CK0，将包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/CIT，将包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/ECL，将包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/MAQ，将包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/MME，将包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209_ubiC/PAM，将包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/PHA，将包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/REH，将包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubiC/SPC，将包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRB209-ubi·C/TBD，将包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的质粒命名为pCRB209-bsdBCD/BS，将包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BAE，将包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BSS，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209_dca/CK0，将包含产气肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EAE，将包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ECL，将包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EH0，将包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ESA，将包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209_dca/ECK，将包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EFE，将包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PPY，将包含菠萝泛菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PAM。将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒pCRB209_aroG/CG、包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒pCRB209-ubiC/EC、包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒pCRB209-ubiC/PP、包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的质粒pCRB209_bsdBCD/BS的构建示于图1中。苯酚生产基因向pCRBl中的克隆将上述的质粒pCRB209-ubiC/EC、pCRB209_ubiC/PP、pCRB209_ubiC/ACB、pCRB209-ubiC/AVN、pCRB209_ubiC/CSA、pCRB209_ubiC/CK0、pCRB209_ubiC/CIT、pCRB209-ubiC/ECL、pCRB209_ubiC/MAQ、pCRB209_ubiC/MME、pCRB209_ubiC/PAM、pCRB209-ubiC/PHA和pCRB209_ubiC/SPC用限制性内切酶Sal I进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、维氏固氮菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约
1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、水油海杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约
1.6-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、地中海海单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、菠萝泛菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.5-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段分别与利用SalI切割后的克隆载体pCRBl [Nakata, K.et al., Vectors for the genetics engineering of corynebacteria;in Saha,B.C.(ed.): Fermentation Biotechnology, ACS Symposium Series862.Washington, AmericanChemical Society: 175-191 (2003)]约4.l_kb在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶10 X缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成·分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接K液、连接L液、连接AN液、连接AO液、连接AP液、连接AQ液、连接AR液、连接AS液、连接AT液、连接AU液、连接AV液、连接AW液和连接AX液。另外，同样地将上述的质粒pCRB209-ubiC/RHl和pCRB209_ubiC/TBD用限制性内切酶BamHI进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、真氧产碱杆菌株来源的UbiC基因和终止子序列的约1.7-kb的DNA片段、连接有gapA启动子、脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因和终止子序列的约1.6-kb的DNA片段与利用BamHI切割后的克隆载体pCRBl [Nakata, K.et al., Vectors for the genetics engineering of corynebacteria;in Saha,B.C.(ed.): Fermentation Biotechnology, ACS Symposium Series862.Washington, AmericanChemical Society: 175-191 (2003)]约4.1-kb在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶10 X缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接AY液和AZ液。使用所得到的连接K液、连接L液、连接AN液、连接AO液、连接AP液、连接AQ液、连接AR液、连接AS液、连接AT液、连接AU液、连接AV液、连接AW液、连接AX液、连接AY液和连接AZ液,利用氯化I丐法[Journal of Molecular Biology, 53，159 (1970)]转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50 μ g/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI或BamHI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRBl的约4.1-kb的DNA片段以外，在大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因(连接K液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因(连接L液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因(连接AN液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在维氏固氮菌株来源的ubiC基因(连接AO液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因(连接AP液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AQ液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因(连接AR液)的情况下，还确认到长度为约
1.5-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因(连接AS液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在水油海杆菌株来源的ubiC基因(连接AT液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在地中海海单胞菌株来源的ubiC基因(连接AU液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的ubiC基因(连接AV液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因(连接AW液)的情况下，还确认到长度为约1.5-kb的插入片段，在真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因(连接AY液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段，在腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因(连接AX液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段，在脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因(连接AZ液)的情况下，还确认到长度为约1.6-kb的插入片段。将包含大肠埃希氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/EC，将包含恶臭假单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/PP(图2)。将包含鲍氏不动杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/ACB，将包含维氏固氮菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/AVN，将包含需盐色盐杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/CSA,将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl_ubiC/CK0，将包含杨氏柠檬酸杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/CIT，将包含阴沟肠杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/ECL，将包含水油海杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/MAQ，将包含地中海海单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/MME，将包含菠萝泛菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl_ubiC/PAM，将包含游海假交替单胞菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/PHA，将包含真氧产碱杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/REH，将包含腐败希瓦氏菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/SPC，将包含脱氮硫杆菌株来源的ubiC基因的质粒命名为pCRBl-ubiC/TBD。苯酚牛产某闵向DCRB15中的克降将上述的质粒pCRB209_aroG/CG用限制性内切酶BamHI进行切割，琼脂糖电泳后，将利用QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社凯杰制造)从琼脂糖凝胶中回收的连接有gapA启动子、谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因和终止子序列的约2.4-kb的DNA片段与利用BamHI切割后的上述质粒pCRB15的约3.8_kb在70°C下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，将得到的DNA片段混合，向其中添加I μ I T4DNA连接酶10 X缓冲液、I单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μ 1，在15°C下反应3小时使其结合。将其作为连接M液。使用所得到的连接M液，利用氯化钙法[Journal of MolecularBiology, 53，159 (1970)]转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有25 μ g/ml博莱霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BamHI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB15的约3.8-kb的DNA片段以外,在谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因(连接M液)的情况下，还确认到长度为约2.4-kb的插入片段。将包含谷氨酸棒杆菌株来源的aroG基因的质粒命名为pCRB15_aroG/CG (图3)。(5)谷氨酸棒杆菌的染色体基因破坏用质粒的构建谷氨酸棒杆菌株PQbA基因破坏用质粒的构建通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上pobA基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一·对弓I物来使用。pobA-1区扩增用引物(a-14):5，-CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG-3’(序列号 40)(b-14):5，-GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG-3’(序列号 41)另外，引物(a-14)上附加有XbaI限制性内切酶位点。pobA-2区扩增用弓丨物(a-15):5，-GAGGTATAAACGCTCGTGTC-3’(序列号 42)(b-15):5，-CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG-3 (序列号 43)另外，引物(b-15)上附加有SacI限制性内切酶位点。模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
TaKaRa LA Taq丨、丨(5 !Μ,./μ1)0.5μ1
IOxLA PCR 缓冲液ΙΙ(无 Mg2+)5μ1
25mM MgCl25μ1
dNTP 混合物(各 2.5mM)8μ1
模板DNA5μ1(ΟΝΑ含量Ipg以下)
上述记载的两种引物 各0.5μ1(终浓度ΙμΜ)
无菌蒸馏水25.5μ1将以上物质混合，将该50 μ I的反应液供于PCR。*)扩增pobA-Ι区时使用引物(a-14)与(b_14)的组合进行，扩增pobA_2区时使用引物(a-15)与(b-15)进行。PCR 循环:变性过程:94°C 60秒退火过程:52°C 60秒延伸过程:72°C
pobA-1 区60 秒pobA-2 区60 秒将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8%的琼脂糖凝胶对10 μ I上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌pobA-Ι区的情况下能够检测到约1.Ο-kb的DNA片段，在pobA-2区的情况下能够检测到约
1.Ο-kb 的 DNA 片段。接着，将由上述PCR扩增出的pobA-Ι区片段与pobA_2区片段各I μ I混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液:
权利要求
1.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。
2.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源的基因、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)来源的基因、维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)来源的基因、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)来源的基因、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、杨氏朽1檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)等朽1檬酸杆菌属细菌来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)来源的基因、地中海海单胞菌(Marinomonasmediterranea)来源的基因、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)来源的基因、真氧产喊杆菌(Ralstonia eutropha)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)来源的基因或脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的基因。
3.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的基因、克氏柠檬酸杆菌来源的基因、产气肠杆菌来源的基因、阴沟肠杆菌来源的基因、霍氏肠杆菌来源的基因、阪崎肠杆菌来源的基因、大肠埃希氏菌来源的基因、弗格森埃希氏菌来源的基因、多粘类芽孢杆菌来源的基因或菠萝泛菌来源的基因。
4.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA， (a)由序列号31、序列号34、序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号85、序列号86、序列号87、序列号88、序列号89、序列号90、序列号91、序列号92或序列号93的碱基序列构成的DNA ； (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
5.如权利要求1所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(c)或⑷的DNA， (c)由序列号37、序列号44、序列号47、序列号50、序列号53、序列号56、序列号59、序列号62、序列号65、序列号68、序列号71或序列号74的碱基序列构成的DNA ； (d)在严格的条件下与由(c)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
6.如权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。
7.如权利要求1 6中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。
8.如权利要求1 7中任一项所述的转化体，其中，编码具有DAHP合酶即3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶活性的酶的基因在宿主棒状细菌内高表达。
9.如权利要求1 8中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
10.如权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是保藏编号为FERMP-18976 的谷氨酸棒杆菌 R、ATCC13032 或 ATCC13869。
11.如权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。
12.如权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是存在于保藏编号为FERM P-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌。
13.如权利要求1 5中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌是保藏编号为FERMP-18976的谷氨酸棒杆菌R、ATCC13032或ATCC13869中高表达编码具有DAHP合酶活性的酶的基因的棒状细菌。
14.保藏编号为NITE BP-995 的谷氨酸棒杆菌 PHE18、PHE11、PHE12、PHE13、PHE14、PHE15、PHE16、PHE17、PHE19-1、PHE19-2, PHE19-3, PHE19-4, PHE19-5, PHE19-6, PHE19-7,PHE19-8、PHE19-9、PHE19-10、PHE19-11、PHE19-12、PHE20-1、PHE20-2、PHE20-3、PHE20-4、PHE20-5、PHE20-6、PHE20-7、PHE20-8、PHE20-9、PHE20-10、PHE20-11、PHE20-12、PHE20-13或PHE20-14的转化体。
15.—种苯酚的制造方法 ，其中，包括: 使权利要求1 14中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤，和 回收反应液中的苯酚的步骤。
16.如权利要求15所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。
17.如权利要求15或16所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200 -500毫伏。
18.如权利要求15 17中任一项所述的苯酹的制造方法,其中,糖类为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖和甘露糖醇组成的组中的糖。
全文摘要
一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate-pyruvate lyase)活性的酶的基因和编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中包括使该转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤。
文档编号C12N1/21GK103221533SQ20118005437
公开日2013年7月24日 申请日期2011年11月9日 优先权日2010年11月10日
发明者汤川英明, 乾将行 申请人:绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合