一种分子改造提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法及其重组菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分子改造提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法和重组酵母菌种。本发明将来源于老鼠(Mus musculus)的ATP柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase，ACL)基因制备重组质粒，并导入耶氏解脂酵母形成重组酵母菌株，重组菌株的油脂含量大副提高。
【专利说明】
一种分子改造提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法及其重组 菌株
技术领域
[0001] 本领域涉及微生物油脂合成，具体提供了一种分子改造的重组酵母菌株，油脂含 量比出发菌株大幅度提高。
【背景技术】
[0002] 微生物油脂（microbial oils)又称单细胞油脂（single cell oil，SCO)，是由酵 母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳 源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值脂质。在适宜条件下，某些微生物产 生并储存的油脂占其生物总量的20%以上，具有这样表型的菌株称为产油微生物。微生物 生产油脂不仅具有油脂含量高、生产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点。微生物油 脂可以被转化为生物柴油（biodiesel)，来缓解日益严重的能源危机和环境问题。微生物油 脂还可以被用来合成多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)比如ALA， GLA，AA，EPA，DHA等等。耶氏解脂酵母是目前研究的最多的一种产油酵母菌株，它有着清晰 的遗传背景和分子操作工具。现在针对耶氏解脂酵母油脂积累的做了大量的研究，对油脂 积累的机制有了较为深刻的理解，但是依然存在一些没有解决的问题。耶氏解脂酵母在氮 营养元素缺乏的培养基培养时，细胞开始积累油脂并存在于细胞内，然后同时发现大量的 有机酸（特别是柠檬酸）被分泌到培养基中，有些菌株甚至达到了商业化生产柠檬酸的水 平。培养过程中氮营养元素耗尽时，细胞生长逐渐停止，大量的柠檬酸在线粒体内聚集并被 转运到细胞质中，柠檬酸此时有两条主要的代谢途径，一是被分泌到细胞外，二是被ACL裂 解生产乙酰辅酶A用来合成脂质。然而耶氏解脂酵母将柠檬酸转化成乙酰辅酶A的能力不 足，所以提高柠檬酸转化成乙酰辅酶A的能力能促进耶氏解脂酵母油脂含量的提高
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种能够提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法和高产油脂的耶氏解 脂酵母菌株。
[0004] 本发明的内容包括：将来源于老鼠的ACL基因克隆形成的重组表达载体 pINA1312sp-acl和pINA1292sp-acl及表达ACL的重组耶氏解脂酵母菌株，还有提高油脂含 量的方法。
[0005] 本发明的重组酵母菌株是将ACL基因制备重组质粒，并导入耶氏解脂酵母形成； 外源基因编码ACL酶的Km值小于或等于产油微生物内源ACL的Km值的10%的基因在微生 物中过表达可以有效提高微生物脂质产量。
[0006] 本发明优选为：根据来源于老鼠的ACL基因，设计引物将其克隆到单拷 贝质粒pINA1312sp和多拷贝质粒pINA1292sp，形成重组质粒pINA1312sp-acl和 pINA1292sp-acl (质粒 pINA1312sp 和 pINA1292sp 参见 Zhang B，Chen H，Li M，Gu Z， Song Y，Ratledge C，Chen YQ，Zhang H，Chen W(2013)Genetic engineering of Yarrowia lipolytica for enhanced production of trans-10,cis_12conjugated linoleic acid. Microb Cell Fact. 12 :70)。
[0007] 具体地，将两种质粒经限制性内切酶No t I酶切后回收转化耶氏解脂酵 母 Polh(耶氏解脂酵母 Polh 参见 Madzak C，Gaillardin C，Beckerich JM. (2004) Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica :a review. J Biotechnol. 109(1-2) :63-81.)。经过同源重组后得到 2 种重组酵母菌株 Polh_1312sp-acl 和 Polh_1292sp-acl。经 western blot 和 ACL 酶活测 定分析重组蛋白的表达情况，可知两种菌株都成功表达ACL，且ACL酶活比出发菌株大幅度 提尚。
[0008] 本发明的另一方面，重组菌株经培养后检测，酵母细胞内油脂含量大幅度提高，并 且蛋白表达量和细胞内油脂含量呈正相关，最高油脂含量（P〇lh-1292sp-acl-6)占细胞干 重的为23%。
【附图说明】
[0009] 图1是重组质粒pINA1312sp-acl和pINA1292sp-acl的结果示意图。
[0010] 图2是acl基因在重组耶氏解脂酵母细胞中的基因拷贝数情况。
[0011] 图3是重组耶氏解脂酵母菌株表达ACL的western blot检测结果。
[0012] 图4是重组耶氏解脂酵母菌株表达ACL酶活情况。
[0013] 图5是重组耶氏解脂酵母菌株生物量的情况，显示ACL表达对生物量有轻微的抑 制作用。
[0014] 图6是重组耶氏解脂酵母菌株油脂含量情况，显示酵母细胞内油脂含量有所提 高，提高的幅度和基因拷贝数及ACL酶活正相关。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1重组表达质粒的构建
[0016] 以含有老鼠 ACL基因的质粒p0 (hph) -acl (江南大学周景文教授馈赠）为模板，设 计引物 ACL-F(CGCC CAC GTG ATG TCA GCC AAG GCA ATT TC)和 ACL-R(CACC GGT ACC TTA CAT GCT CAT GTG TTC TG)通过PCR对ACL基因进行扩增。PCR程序为 95°C 30s，60°C 30s， 68°C 3min30s，总共30个循环。得到的片段连接到pMD19T载体（购于TaKaRa公司），得 至lj pMD19T-acl。得到的 pMD19T-acl 和目的载体 pINA1312sp 和 pINA1292sp 经过 Pml I 和 Κρη I酶切3h后，1 %琼脂糖电泳，回收目的载体片段和基因片段，将二者经T4连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌T0P10细胞，筛选阳性转化子，并经过测序验证ACL基因已经连接到 目的载体上，最后得到重组质粒pINA1312sp-acl和pINA1292sp-acl，重组质粒示意图见图 1〇
[0017] 实施例2重组耶氏解脂酵母菌株的构建
[0018] 2 种重组质粒 pINA1312sp-acl 和 pINA1292sp-acl 经过 Not I 酶切处理 3h 后， 1%琼脂糖电泳回收带有目的基因的表达单元的DNA片段，浓缩至500ng/ul，取2ul用于 转化耶氏解脂酵母 Polh(转化过程参考 Barth G，Gaillardin C(1996)Non_conventional yeasts in biotechnology. Springer，Berlin)。最后得到的转化子YNBD培养提取基因组， 用引物ACL-F和ACL-R PCR验证基因是否整合到基因上。PCR程序为95°C 30s，60°C 30s， 68°C 3min30s，总共30个循环。重组酵母细胞培养过，细胞破碎提取蛋白质，一部分蛋白质 做western blot检测，ACL蛋白质抗体（购于Cell Signaling Technology公司），结果 如图3所示，各株重组酵母菌株均有所表达ACL蛋白质。另外一部分蛋白质测定ACL酶活 性（酶活性测定参考Srere PA(1959)The citrate cleavage enzyme. I. Distribution and purification. J Biol Chem. 234:2544-2547)。结果显示各株重组酵母菌株的ACL活性均 有所提高，且和基因拷贝数正相关，具体结果见图4。
[0019] 实例3重组耶氏解脂酵母的脂质含量测定及脂肪酸组成分析
[0020] 各株重组酵母在产脂培养基中培养，培养条件为28°C，200rpm，50ml培养于 250ml 摇瓶。培养基参考 Zhang H，Zhang L，Chen H，Chen YQ，Ratledge C，Song Y，Chen ff(2013b)Regulatory properties of malic enzyme in the oleaginous yeast,Yarrowia lipolytica, and its non-involvement in lipid accumulation. Biotechno1 Lett.35 ： 2091-8. doi : 10. 1007/sl0529-013-1302-7)。培养 4 天后 8000rpm 离心 5min 收集菌体，冷 冻干燥，得到重组酵母菌株的生物量。取30mg冻干菌体用氯仿甲醇萃取提取脂质，最后经 10%盐酸甲醇60°C水浴甲酯化，加2ml正己烷萃取，3000rpm离心3min，取lml上层正己烷 层于GC瓶中，GC-MS检测。
[0021] 生物量结果发现，所有重组酵母的生物量均有所下降，具体的结果见图5。通过 GC-MS检测得到的结果发现，重组酵母菌株的脂质含量均有所提高，并且提高的幅度和ACL 蛋白质表达量的增加量相关联，其中最高脂质含量为P〇lh-1292sp-ACL-6,脂质含量达到细 胞干重的23%，其他菌株的油脂含量见图6。而各株重组的酵母的脂肪酸组成分析发现， ACL表达并没有改变酵母的脂肪酸组成，各株菌株之间的脂肪酸差别也不大，具体数据见表 1〇
[0022] 表1重组酵母的脂肪酸组成
[0023]
[0024] 以上内容是结合具体的优选技术方案对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种分子改造提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法及其重组菌株，其特征在于：ACL 基因制备重组质粒，并导入耶氏解脂酵母形成重组酵母菌株；外源基因编码ACL酶的Km值 小于或等于产油微生物内源ACL的Km值的10%的基因在微生物中过表达可以有效提高微 生物脂质产量。2. 权利要求1的方法，其中所述ACL基因来源于老鼠 （Mus musculus)，其Km值为 0. 05mM〇3. 含有权利要求2的基因的重组表达质粒。4. 如权利要求3所述，重组表达质粒为pINA1312sp-acl和pINA1292sp-acl，其基因序 列如序列表中所示。5. 含有权利要求2所述的基因或者权利要求3-4所述的重组表达质粒的耶氏解脂酵 母。6. 权利要求5中所诉的耶氏解脂酵母，具体是耶氏解脂酵母Polh，其ACL粗酶Km值为 3. 5mM〇7. 权利要求3-4所述的重组质粒，或者权利要求5-6中所述的重组耶氏解脂酵母用于 提高耶氏解脂酵母油脂含量的方法。
【文档编号】C12R1/645GK105886524SQ201410437626
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年8月29日
【发明人】宋元达, 张怀渊
【申请人】江南大学