分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法。本发明以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5’半长的重组质粒pA?F123和含有BVDV VEDEVAC株Erns基因的重组质粒pE?B?Erns为模板，在两端设计20bp同源片段，使用一步定向克隆试剂盒，获得重组pA?B?Erns?F123质粒；用BamH I和Sal I将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的F456片段从重组质粒pB?F456中切下，克隆于相同酶作用的pA?B?Erns?F123中，获得重组质粒pA?B?Erns?FL。本发明的反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选，使用RNA聚合酶Ⅱ系统能够高效和稳定地拯救猪瘟病毒感染性cDNA克隆。
【专利说明】
分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方 法，属于携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因的重组猪瘟病毒的拯救和应用领域。
【背景技术】
[0002] 猪痕（Classical Swine Fever，CSF)是由猪痕病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种接触性、致死性传染病，以高热和出血为其典型特征，发病率和死 亡率极高，被世界动物卫生组织(0ΙΕ)列为必须申报的动物疫病。猪瘟对养猪业危害严重， 常造成巨大经济损失。
[0003] CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，CSFV基因组为单 股正链线性RNA分子，基因组大小为12.3kb，两端分别为Y端非翻译区（Untranslated Region，UTR)和3'端UTR，中间包含一个大的开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，其中 0RF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内， 受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解为11种病毒特异性蛋白，包括4种病毒结构 蛋白（C、Erns、El和E2)和7种非结构蛋白[1]，其中诱导机体产生抗体的蛋白主要是E2和 Erns〇
[0004]牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪痕病毒同为痕病毒属病毒，囊膜蛋白gp48又可称E0 或Erns，由227个氨基酸组成，含9个糖基化位点的蛋白，并具有T2RNases活性[2]，其生物学 活性与猪瘟病毒Erns具有很多类似之处。经氨基酸序列分析发现Erns保守性高，且其上有 中和表位，可用其研究基因工程疫苗，也可作为基因工程诊断抗原。
[0005] 目前，猪瘟疫情的防控主要是对感染猪进行严格扑杀和对周边地区进行消毒，在 许多国家和地区，疫苗免疫依然是控制猪瘟的重要手段，而由我国1954年研发的基因1型猪 瘟兔化弱毒C株疫苗使用最为广泛。在相当长时间内，由于其性能稳定、免疫效果好，被国内 外公认为安全有效的弱毒疫苗。但该疫苗存在一定缺陷：疫苗免疫后不能区分诱导的抗体 为免疫动物还是野毒感染。因此，改造和开发能够进行鉴别诊断的新型标记猪瘟弱毒疫苗 以及配套的鉴别检测方法成为热点。其中，欧盟多个实验室联合开发的以BVDV CP7株为骨 架，将E2基因替换为CSFV Alfort/187株E2基因的重组疫苗CP7-E2alf以及血清学检测方法 已经走在前列[3]。然而，由于其骨架为BVDV，免疫后针对BVDV Erns抗体水平低，鉴别诊断 还有一定难度，其次，免疫后细胞免疫水平可能不及C-Strain，无法用于紧急免疫，最后，其 插入E2基因所属毒株并不在中国流行，引入存在极大生物安全隐患，因此，开发和研制适 合我国猪瘟流行实际情况的新型分子标记疫苗迫在眉睫。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种构建分子标记猪 瘟病毒弱毒疫苗的方法。
[0007] 为解决技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0008] 提供一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：
[0009] (1)扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段；
[0010] (2)利用步骤(1)的序列扩增带有20bp猪瘟病毒疫苗C株同源区序列的片段；
[0011] (3)以重组质粒PA-F123为模板，反向融合PCR获得缺失猪瘟病毒疫苗C株Erns的基 因组5'半长；
[0012] (4)利用一步定向克隆将步骤(1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获 得携带有BVDV Erns的C株基因组5'半长的重组pA-B-Erns-F123质粒；
[0013] (5)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3'半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切 下，克隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA-B-Erns-FL;
[0014] (6)将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细 胞，收获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC-B-Erns，该子代病毒粒子即为分子标记 猪痕病毒弱毒疫苗。
[0015] 本发明中，在步骤⑴中扩增牛病毒性腹泻病毒的Eras基因编码区的片段时，使用 下述两条特异性引物通过RT-PCR扩增cDNA片段：
[0016] 上游引物：5 ' -GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA;和
[0017] 下游引物：5 ' -TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。
[0018] 本发明中，所述步骤（2)是将CSFV⑶RE蛋白C端和E1蛋白N端20bp碱基引入BVDV Erns片段中，并使用下述两条特异性引物扩增携带有该同源片段的序列：
[0019] 上游引物：
[0020] 5;-TGTACCAACCAGTTGAAGCCGAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA；
[0021] 和下游引物：
[0022] 5，-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。
[0023]本发明中，所述步骤(3)是使用下述两条特异性引物进行扩增的：
[0024] 上游引物：5，-CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA;和
[0025] 下游引物：5 ' -GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG。
[0026]本发明中，所述步骤(5)中将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3'半长的F456片段从重 组质粒PB-F456中切下时，使用的是限制性内切酶BamHI和Sal頂每。
[0027]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0028] 1、本发明的反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新 的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病 毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选，使用RNA聚合酶Π 系统已经能够高效和稳定地拯 救猪瘟病毒感染性cDNA克隆。研究实例中，将猪瘟病毒C株Erns基因替换为BVDV基因型lb的 Erns基因并拯救获得具有感染性的重组病毒，命名为RecC-B-Erns，为开发分子标记猪瘟弱 毒疫苗奠定了基础。
[0029] 2、本发明构建的嵌合cDNA pA-B-Erns-FL，能够快速收获到具有感染性的子代病 毒粒子;拯救的重组病毒保留了 C株诱导兔体产生定型热反应以及在兔体内复制等特性，通 过对重组病毒第5、15和20代Erns测序发现嵌合基因未发生突变或者丢失现象，说明其遗传 稳定性较好;本发明还通过改变疫苗C株主要宿主免疫性抗原Erns的抗原性，诱导产生的血 清具有潜在的鉴别诊断价值。
【附图说明】
[0030] 图1为基于猪瘟病毒C株为骨架嵌合BVDV Erns基因 cDNA全长感染性克隆构建示意 图。
[0031] 图2为基因扩增及酶切鉴定图，Μ为Wide Range DNA Marker(500-15,000);其中A 泳道1为反向PCR扩增的线性化pA-F123,泳道2为BVDV-Erns基因；B泳道1为BamHI和Sail酶 切的质粒pA-B-Erns-F123，泳道2为相同酶切的含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3 '半长的重组 质粒pB-F456;C泳道1为嵌合完成的重组质粒pA-B-Erns-FL，泳道2为BamHI和Sail双酶切鉴 定结果。
[0032] 图3为体外转录RNA电转PK细胞系后，间接免疫荧光(IFA)检测病毒蛋白表达情况； 利用抗C-Strain E2的特异性单克隆抗体6B8检测重组病毒连续传代不同代次病毒蛋白的 表达情况，A、B、C分别为第1、5、10代重组病毒，D为第10代病毒上清感染ST细胞后，病毒蛋白 的表达情况。
[0033]图4为重组病毒在ST细胞中生长曲线图；A为细胞中RNA拷贝数;B为不同时间点病 毒 TCID50。
[0034] 图5为重组病毒RecC-B-Erns和商品化疫苗Vaccine C接种实验动物兔后体温变化 曲线。
[0035] 图6为重组病毒RecC-B-Erns和亲本C株全病毒多抗与C-Strain囊膜糖蛋白E2， Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之间反应性对比图。其中，A为重组病毒RecC-B-Erns与C-Strain囊膜糖蛋白E2，Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之间反应性对比图，B为亲本C株全 病毒多抗与C-Strain囊膜糖蛋白E2，Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之间反应性对比图。
【具体实施方式】
[0036]本发明通过将牛病毒性腹泻病毒Erns基因替换至疫苗C株感染性克隆上，拯救获 得重组猪瘟病毒，克服了现有技术中Erns改造后无法快速拯救子代病毒的不足。同时，本发 明还提供了基于Erns基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建策略及应用，在保留疫苗C株 在兔体内复制且对猪无致病力等特性的基础上，通过该重组嵌合方式快速拯救并获得子代 病毒粒子。同时，该候选重组病毒能够提供可靠的细胞和体液免疫，并具有潜在的鉴别诊断 价值。
[0037] 参考附图，下面将对本发明进行详细描述。
[0038] 实施例1: BVDV基因型lb的Erns基因的扩增。
[0039] 根据BVDV基因型lb的Erns基因序列，在两端设计特异性引物：
[0040] B-E0-F：5-GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA(SEQ ID NO：1)
[0041] B-E0-R：5-TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT(SEQ ID NO：2)
[0042] BVDV lb型Erns基因序列参照GenBnak(Accesion N.KC695814)并合成。根据上述 设计的引物，扩增片段，并使用高保真酶扩增，获得片段（图2)。其中，引物名称中B表示 BVDV，E0表示基因 Erns，F表示上游引物，R表示下游引物。获得片段克隆于TransGen (全式 金)公司的pEASY-Blunt载体上，进行测序。
[0043] 实施例2:重组嵌合质粒pA-B-Erns-F123的构建。
[0044] 将CSFV CORE C端和E1N端20bp碱基引入BVDV Erns片段中，使用下述两条特异性 引物扩增携带有该同源片段的序列。
[0045] 上游引物B-H-E〇-F(SEQ ID N0:3):
[0046] 5;-TGTACCAACCAGTTGAAGCCGAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA
[0047] 下游引物B-H-E〇-R(SEQ ID N0:4):
[0048] 5'-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT
[0049] 其中，引物名称中B表示BVDV，E0表示基因 Erns，H表示增加同源序列，F表示上游引 物，R表示下游引物。
[0050] 使用下述两条特异性引物，以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5'半长的重组质粒pA-F123为模板，扩增Erns以外的基因片段；
[0051 ]上游引物F123-F(SEQ ID N0:5):
[0052] 5;-CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA
[0053] 下游引物F123-R(SEQ ID N0:6):
[0054] 5，-GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG
[0055] 其中，引物名称中F123表示重组质粒pA-F123，F表示上游引物，R表示下游引物。
[0056] pA-F123为携带猪瘟病毒疫苗C株基因组的质粒，pA表示低拷贝质粒pACYC-177， F123表示猪瘟病毒疫苗C株基因组5'半长。
[0057] 利用Vazyme (诺唯赞）公司一步定向克隆试剂盒将上述PCR产物连接并转化DH5a感 受态细胞，将阳性克隆该段扩增，获得重组的pA-B-Erns-F123质粒;产物测序与预期一致。 [0058] 实施例3:重组嵌合质粒pA-B-Erns-FL全长cDNA的构建。
[0059] (1)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3'半长的F456片段用限制性内切酶BamH I和 Sal I酶从重组质粒pB-F456中切下，酶切产物经割胶回收后克隆于相同酶作用的pA-B-Erns-F123中，获得携带BVDV Erns基因的感染性cDNA载体pA-B-Erns-FL，并用BamHI和Sail 酶切鉴定，大小一致（图2);对含有全长cDNA的细菌进行连续传代，第10代细菌抽提质粒后 对替换区域进行测序，测序结果与预期一致。这一结果表明，通过本发明构建的携带BVDV Erns基因的感染性cDNA载体在宿主菌内是稳定的。
[0060] 实施例4:重组嵌合病毒的拯救。
[00611 200ml LB培养基中加入培养过夜的菌液500μ1，同时加入浓度为100mg/ml的 Amp200yl，37°C扩大培养12h。收集菌液后用Promega公司中量质粒纯化试剂盒抽提质粒。经 浓度测定的质粒用限制性内切酶Xhol进行线性化。线性化的质粒经纯化后用MEGAscript体 外RNA合成试剂盒(Ambion公司）。体外转录获得的RNA经电泳检测完整性和正确性。经浓度 测定后存放于_80°C备用。
[0062]电转前一天，将ST或PK-15细胞分瓶。电转时，将前一天分瓶的细胞消化后，用PBS 洗涤细胞2次。将1~1.5yg上述RNA与细胞混匀后加入0.2cm的电转杯(Bio-Rad公司）中，用 电转仪Gene Pulser Xcell(Bi〇-Rad公司）进行电转，电转参数为150V，500yF，电阻无穷。电 转后用完全培养基将细胞重悬后加入培养瓶中，37°C，5%C02培养。电转后96h进行IFA鉴 定，结果显示电转不同RNA的细胞均可检测到荧光信号，且呈典型戒指状的核周围染色（图 3)。细胞经胰酶消化后以1:4的比例继续连续传代培养。在检测是否产生感染性子代病毒 时，将细胞_76°C/37°C反复冻融三次，离心去除细胞碎片后取上清接种新的ST或PK-15细 胞，37°C培养96h后IFA检测（图3D)。结果显示转录的RNA在细胞内能复制并合成病毒蛋白， 最终产生具有感染性的子代病毒，并命名为RecC-B-Erns，该子代病毒粒子即可作为分子标 记猪瘟病毒弱毒疫苗。这一结果表明通过本发明用BVDV Erns基因替换疫苗C株的Erns基 因并不影响重组病毒在细胞内RNA的复制、蛋白的合成以及子代病毒的包装和释放。
[0063]实施例5:重组嵌合病毒在ST细胞中生长曲线。
[0064]在24孔板中接入2 X 105/孔的ST细胞，待长成70 %融合度后，分别接种RecCpp40 (第40代C株重组病毒）、RecC-B-Erns各200个TCID5Q，每个病毒设置多个重复孔。待病毒吸附 1.5h后，加入生长培养液继续培养。感染后不同时间点分别收集总培养物，细胞RNA以及培 养上清，直至感染后96h，样品于-80°C保存。最后分别测定不同时间点的子代病毒TCID 50以 及病毒基因组拷贝数(图4)。
[0065]实施例6:重组嵌合病毒在兔体内的复制及抗体反应性鉴定。
[0066] 将传至第10代的重组病毒RecC-B-Erns，以103TCID5Q感染家兔，阳性对照组为猪瘟 病毒C株脾淋苗，阴性对照为MEM培养液。每天测量体温3次，在感染后的24-72h可观察到给 予重组病毒和阳性对照的三组兔子体温升高（图5)，且在感染后的第5天再次相同剂量的病 毒感染并没有再次出现特异性升温。而阴性对照组的家兔第一次没有升温，再次给予后出 现与实验组之前类似的体温反应。
[0067]收集第28天RecC-B-Erns组和阳性对照组兔血清，利用间接ELI SA，分别与纯化的 重组蛋白C-E2、C-Erns和BVDV-Erns反应，结果表明重组病毒和疫苗C株产生的全病毒血清 与C-E2反应性基本一致，同时，都能够与两种Erns蛋白反应，存在交叉反应性，但与同源 Erns蛋白反应性显著高于异源Erns蛋白，存在潜在鉴别意义。
[0068]还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上 实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联 想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段； (2) 利用步骤(1)的序列扩增带有20bp猪瘟病毒疫苗C株同源区序列的片段； (3) 以重组质粒pA-F123为模板，反向融合PCR获得缺失猪瘟病毒疫苗C株Erns的基因组 5'半长； (4) 利用一步定向克隆将步骤（1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获得携 带有BVDV Erns的C株基因组5'半长的重组pA-B-Erns-F123质粒； (5) 将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3'半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克 隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA-B-Erns-FL; (6) 将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细胞，收 获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC-B-Erns，该子代病毒粒子即为分子标记猪痕 病毒弱毒疫苗。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中扩增牛病毒性腹泻病毒的 Erns基因编码区的片段时，使用下述两条特异性引物通过RT-PCR扩增cDNA片段： 上游引物:5' -GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA;和 下游引物：5 ' -TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是将CSFV CORE蛋白C端和El 蛋白N端20bp碱基引入BVDV Erns片段中，并使用下述两条特异性引物扩增携带有该同源片 段的序列： 上游引物： 5 ltgtaccaaccagttgaagccgagaacataacacaatggaacctacaagataatggga; 和下游引物： 5'-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是使用下述两条特异性引物 进行扩增的： 上游引物：5' -CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA;和 下游引物：5 ' -GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中将含有猪瘟病毒疫苗C株基 因组3'半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下时，使用的是限制性内切酶BamHI和Sal I 酶。
【文档编号】C12N15/40GK105886531SQ201610224932
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】方维焕, 廖迅, 李肖梁
【申请人】浙江大学