[0121] DMEM培养基+10%标准胎牛血清。
[0122] 2、PBS (平衡盐溶液）
[0123] 在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HP04和0.24g KH2P04用HC1 调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。
[0124] 3、0· 25 %胰蛋白酶消化液
[0125] 0.25g胰蛋白酶加入100ml去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
[0126] 二、实验方法
[0127] 1、细胞传代
[0128] (1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25 %胰蛋白酶液lml，覆盖 细胞层，瓶口消毒，加盖；
[0129] (2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形， 细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10%胎牛血清的培养 液终止消化；
[0130] (3)细胞计数:取上述细胞悬液0.5ml，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞 计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞 按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数： 细胞总数/ml = 4大格细胞总数/4 X 104 X稀释倍数；
[0131] (4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3 X105个细胞 浓度，分装于培养瓶中（8ml/每瓶），放置于37°C，5 % C02培养箱中培养。2. miRNA瞬时转染 [0132]采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照Lipofectamin?2000试剂说明书进 行。转染前24h将生长状态良好的细胞接种到12孔板中，细胞计数约2 X104,常规培养至转 染当天，细胞融合度为50-60%时进行试验。将20nM/40nM/80nM miRNA mimic加入到100ul DMEM培养基中，轻柔混匀；另用lOOulDMEM培养基稀释2ul Lipof ectamin?2000脂质体，轻柔 混匀，室温孵育5min;混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合 物;然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养6h后更换完全培养基。其中，非特 异性序列作为阴性对照。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。
[0133] 3.实验结果：
[0134] 将miR-1299mimics转染至人骨肉瘤细胞株MG-63中，48h后提取细胞总RNA，空白对 照为未转入miRNA的人骨肉瘤细胞株细胞，非特异性序列作为阴性对照。定量PCR检测靶基 因 C5AR1、ITPRIP的mRNA的水平变化。结果显示2个基因的表达均有不同水平的下调，表明 C5AR1、ITPRIP都是miR-1299的目标靶基因，其中ITPRIP基因下调更为明显。
[0135] 实施例5转染miR-1299对骨肉瘤细胞增殖的影响
[0136] 一、实验材料
[0137] 人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
[0138] 序列合成：将miR-1299序列发给上海吉玛公司，由其合成miR-1299mimics、anti-miR-1299。核苷酸序列的5 '端用FAM修饰，可发绿色焚光，转染进细胞后可以在焚光显微镜 下观测。
[0139] miR_1299mimics 序列：
[0140] 5，-UUCUGGAAUUCUGUGUGAGGGA/CCUCACACAGAAUUCCAGAAUU-3，（SEQ ID N0 8)
[0141] anti-miR-1299序列：
[0142] 5，-UCCCUCACACAGAAUUCCAGAA-3，（SEQ ID NO 9)
[0143] 二、实验方法
[0144] 1 · Transwell迀移实验检测细胞迀移能力
[0145] 1)采用含8um孔径聚碳酯膜的Transwell小室24孔板，在Transwell小室的下室中 预先加入600ul含10 %FBS的DMEM培养液，37°C平衡1小时。
[0146] 2)收集各组对数期细胞，用PBS(pH7.4)漂洗3次，含10%FBS的RPMI 1640培养液重 悬各组细胞，计数后调整细胞密度为5 105个/ml，取100ul/孔加入上室。置于5%⑶2、37°C 恒温培养箱中孵育48小时。
[0147] 3)取出Transwell小室，用棉签刮除滤膜上室面的细胞。
[0148] 4) PBS漂洗后用4 %多聚甲醛固定，结晶紫染色。
[0149] 5)在200倍显微镜下计数滤膜下室面的细胞数，每个孔随即计数5个视野中的细胞 数目。取其平均值，以迀移细胞的数目来表示各组细胞的迀移能力。
[0150] 2. Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力
[0151 ] 1)提前一天冰上融化Matrigel，准备预冷的Tip、移液枪、Transwell小室。
[0152] 2)将细胞外基质Matrigel，按50ul/cm2的比例加入Transwell小室的聚碳酯膜的 上表面，37°C放置30分钟使其成胶。
[0153] 3)在Transwell小室的下室中预先加入600ul含10%FBS的DMEM培养液，37°C平衡1 小时。
[0154] 4)收集各组对数期细胞，用PBS(pH7.4)漂洗3次，含10%FBS的RPMI 1640培养液重 悬各组细胞，计数后调整细胞密度为5 105个/ml，取100ul/孔加入上室。置于5%⑶2,37°C 恒温培养箱中孵育48小时。
[0155] 5)取出Transwell小室，用棉签刮除滤膜上室面的细胞。
[0156] 6) PBS漂洗后用4 %多聚甲醛固定，结晶紫染色。
[0157] 7)在200倍显微镜下计数滤膜下室面的细胞数，每个孔随即计数5个视野中的细胞 数目。取其平均值，以迀移细胞的数目来表示各组细胞的侵袭能力。
[0158] 三、实验结果
[0159] 荧光显微镜观察转染效率。24小时后，荧光显微镜下观察，miR-1299mimics、anti-miR-1299均被成功转染进骨肉瘤细胞MG-63中，具有荧光颗粒的细胞占细胞总数85%-90% 左右，显示转染成功。
[0160] 用Transwell小室迀移和侵袭实验来分析miR-1299对细胞MG-63迀移和侵袭能力 的影响，结果显示，转染miR-1299mimics的MG-63细胞迀移和侵袭的能力较对照组均有明显 的下降，同时，转染anti-miR-1299的MG-63细胞迀移和侵袭的能力较对照组均有明显的提 尚。
[0161]虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各 种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来 使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
【主权项】
1. mir-1299及其成熟miRNA在制备诊断和/或防治骨肉瘤试剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨肉瘤为转移性骨肉瘤。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，防治骨肉瘤试剂包括上调mir-1299及其成 熟miRNA的转录和/或促进mir-1299及其成熟miRNA的活性的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或 基因特异性miR Mimics技术上调mir-1299及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-1299及其 成熟miRNA的活性，优选人工合成miR-1299的短发夹RNA或通过调控启动子上调mir-1299及 其成熟miRNA的表达。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断骨肉瘤试剂包括基于高通量测序方法 和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟 miRNA的转录或基于免疫检测方法检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA调控的靶基 因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE 法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA的转录； 采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本中mir-1299及其成熟miRNA调控的靶基因的 表达情况。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控的靶基因为C5AR1和/或ITPRIP基因， 优选ITPRIP基因。 7. mir-1299及其成熟miRNA的靶基因在制备诊断和/或防治骨肉瘤制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，靶基因为C5AR1和/或ITPRIP基因。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，诊断骨肉瘤制剂采用荧光定量PCR试剂盒 或基因芯片或免疫方法检测外周血中C5AR1和/或ITPRIP基因的表达。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，防治骨肉瘤的制剂中含有抑制C5AR1和/ 或ITPRIP基因的转录或表达的试剂或化合物。
【专利摘要】本发明涉及mir-1299及其成熟miRNA的新用途。发明对转移性骨肉瘤患者及健康对照人群进行测序，获得其miRNA和mRNA的表达数据，筛选出候选的miR-1299及其靶基因C5AR1、ITPRIP。进一步的荧光定量实验结果显示miR-1299及其靶基因与骨肉瘤密切相关，抑制miR-1299的表达能有效抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。本发明为临床提供很好的骨肉瘤转移诊疗靶点，具有很好的实际应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483275
【申请号】CN201610068656
【发明人】李曙光, 杜玉梅, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年2月1日