化，从而能够以单位用量形态 制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或 乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散 剂或者稳定剂。
【附图说明】
[0056] 图1是RT-PCR检测转移性骨肉瘤中miR-1299相对表达水平图 [0057] 图2是RT-PCR检测转移性骨肉瘤中C5AR1相对表达水平图 [0058] 图3是RT-PCR检测转移性骨肉瘤中ITPRIP相对表达水平图
【具体实施方式】
[0059] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0060] 实施例1样品的收集及总RNA提取
[0061 ] 5例转移性骨肉瘤患者及5名健康对照。转移性骨肉瘤患者组5例及对照组5人要求 空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝 管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入lml Trizol试剂（Invitrogen公司），充分混勾，-80 °〇保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准， 患者知情同意。
[0062] RNA提取标准：RNA纯度：0D260/280 g 1 · 8，28S/18S g 1; RNA完整性：RIN值 g 7 · 0。 RNA完整性检测方法:Agilent 2100(RNA 6000 Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓 度：1 %琼脂糖胶；电压:5V/cm;时间：20min)。
[0063] 实施例2测序及数据分析
[0064] 测序:运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA和miRNA进行 测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
[0065] 通过转录组数据分析软件对miRNA及mRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得 至丨JP值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA及mRNA。设定p值<0.01，共筛选 出12个差异表达的miRNA，其中表达水平下调的miRNAl 1个。分析过程中设定P值< 0.05，共 筛选出425个差异表达的mRNA，其中表达水平上调的基因324个。利用包括RNA22，miRanda， miRDB，miRWalk，PICTAR2及Targetscan这些算法预测差异表达miRNA的靶基因，选取2 4个 算法预测出来的靶基因，并在miRWalk数据库查找已验证的差异表达的miRNA的靶基因，然 后将所有靶基因与mRNA测序结果中与miRNA表达负相关的基因进行整合分析，我们共得到 105个miRNA-靶基因关系对，通过预测得到上调miRNA(miR-1299)的miRNA-靶基因关系对， 其靶标基因为C5AR1、ITPRIP等。
[0066] 实施例3Real-time PCR检测骨肉瘤组织中miR-1299和C5AR1和ITPRIP基因的表达 [0067] 1样品米集：
[0068] 49例转移性骨肉瘤肿瘤患者和63例健康对照的外周血均来自医院(采集时间2014 年4月-2015年8月）。
[0069] 2 总 RNA 提取：
[0070] 相关实验物品的去Rnase的处理：
[0071] ①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120°C高压20min，180°C高温烤干2 小时以上。
[0072]②将塑料器皿（如:EP管/枪头）使用前需用0.1%DEPC水侵泡过夜，后控干液体， 120°C高压20min，烤箱烤干备用。
[0073]白细胞分离
[0074] (1)取2ml抗凝外周血(采血时间不超过3h);
[0075] (2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；
[0076] (3)加入4ml淋巴细胞分离液于另一离心管；
[0077] (4)吸取4ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞 分离液混合）。离心1500rpm 20min;
[0078] (5)用吸管轻轻吸出界面层（白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗 涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。
[0079] RNA 提取
[0080] (1)先加 lml Trizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解 后室温静置5-10min;
[0081 ] (2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4°C下12000转离心15min;
[0082] (3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层），加入500: 1异丙醇，颠倒混匀，室温静置l〇min;
[0083] (4)4°C1 2000g离心1 Omin，弃上清液，底部可见白色物质；
[0084] (5)加入lml 75%冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；
[0085] (6)4°C7500g离心5min，去除乙醇后晾5-10min，半透明即可，以20ulDEPC水溶解 RNA。取3u 1RNA样本，于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳；lulRNA样品于紫外分光光度计检测浓度， 以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
[0086] 3逆转录
[0087] mRNA 逆转录：
[0088] 取lyg总RNA作为模板RNA，米用 Superscript? 111 Reverse Transcriptase (invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA 保存放_20°C冰箱备用。
[0089] miRNA 逆转录：
[0090] RT体系的配制：lyg总RNA作为模板RNA;5XmiScript HiSpec Buffer 4μ1;10Χ Nucleics Mix 2μ1 ；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μ1;灭菌水补平至20μ1 〇ABI 9700型PCR仪上37°C保温60min使逆转录反应完全后，95°C5min终止反应。加入80μ1 Nuclease-free Η20稀释至100μΙ储存在_20°C冰箱备用。
[0091] 4荧光定量PCR
[0092] 引物设计：
[0093] C5AR1 引物（ΝΜ_001736·3):
[0094] 正向引物：5'-GTAAGTAATGATACAGAGG-3'SEQ ID NO 4
[0095] 反向引物：5'-GTCAATATCCTGGTTATG-3'SEQ ID NO 5
[0096] 扩增产物长度102bp。
[0097] ITPRIP 引物（ΝΜ_033397·3):
[0098] 正向引物：5'-CTATGATGTAGGTGCTATTCT-3'SEQ ID NO 6
[0099] 反向引物：5'-ACAGTAGGTAAGTCAGTTG-3'SEQ ID NO 7
[0100] 扩增产物长度83bp。
[0101] mRNA的RT-PCR体系的配制：
[0102]
[0103] mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以actin作为内参。
[0104] 扩增程序为:95° 10min，45个循环(95°C 15s，52°C60s)。
[0105] miRNA的RT-PCR体系的配制：
[0106]
[0107] miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。
[0108] 扩增程序:95°ClOmin; 40个循环(95°C 10s，60°C30s)。
[0109] 5统计学分析
[0110] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效 率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高;样本扩增产物溶 解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2_ 八(^\100%，比较11^1?-1299工541?1、1了?1?1?基因在转移性骨肉瘤组和正常组中的表达水 平。结果显示:qRT-PCR扩增结果稳定，其中miR-1299在转移性骨肉瘤组表达水平明显低于 正常对照组，约是对照的六分之一(具体见图1)，而C5ARUITPRIP在转移性骨肉瘤组中的表 达水平均高于正常对照，C5AR1在转移性骨肉瘤组中表达水平约为对照组的1.7倍(具体见 图2)，ITPRIP在转移性骨肉瘤组中表达水平约为对照组的2.6倍(具体见图3)，以上结果验 证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
[0111] 实施例4miR-1299与C5AR1和ITPRIP靶基因关系验证
[0112] -、材料准备：
[0113]( - )标本来源
[0114]人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
[0115](二）主要试剂
[0116] LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)〇
[0117] C5AR1、ITPRIP引物设计(见实施例3):
[0118] miR-1299序列发给合成公司，请其化学合成miR-1299mimics及非特异性对照。
[0119] (三)主要溶液
[0120] 1、细胞培养液