检测鼻咽癌患者血清中长链非编码rna loc284454表达量的试剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及检测鼻咽癌患者血清中长链非编码 RNA L0C284454表达量的试剂用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Project，ENC0DE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA, IncRNAhLncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中IncRNA 序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA不断被 发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层 面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。 [000 3] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱t耳（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究 表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽癌的 发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们发现IncRNA L0C284454(NCBI accession number :NR_036515)在鼻咽癌组织和血清中表达上调，针对该IncRNA的检测制 剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。我们进一步增加样本，在112例有临床随访资料的鼻咽癌 石錯存档标本中，通过原位杂交（in situ hybridization)的方法检测了L0C284454的表达 水平，发现L0C284454在鼻咽癌组织中表达上调，高表达L0C284454的鼻咽癌患者比低表达 L0C284454的鼻咽癌患者预后差，因此针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后 判断。
[0005] 我们通过设计并合成靶向L0C284454的短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNAs) 序列，构建了靶向L0C284454的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸 鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰L0C284454的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转 移能力。将L0C284454的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因 转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护L0C284454的RNA干扰载体免受核酸酶降解， 延长作用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供检测鼻咽癌患者血清中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂的用途。
[0007] 检测鼻咽癌患者血清中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂的应用，所述的 试剂用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂;该长链非编码RNA L0C284454的序列如 SEQ N0:1 所示。
[0008] 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂为实时荧光定量检测试剂。
[0009] 所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测L0C284454表达的引 物序列：
[0010] 正向引物：5'-八丁0：0^八(：1'0^^^八(^66-3'，
[0011] 反向引物：5'-ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3'。
[0012] 所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于对照的检测质粒PGL3中萤火虫荧光素 酶基因的正向引物为5'-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3'和反向引物5'-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3'。
[0013] 检测鼻咽癌血清L0C284454表达量的方法，步骤如下：（1)将待检测的血清标本 1600g离心10分钟，分离上清液，每3ml血清与lng的pGL3质粒混合，抽提核酸(包括RNA和质 粒DNA);
[0014] (2)RT-PCR扩增:将抽提的RNA进行反转录得CDNA，取含有PGL3质粒DNA的CDNA为模 板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物以及PCR反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq;同 时，pGL3质粒DNA液10倍梯度稀释，作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值； 内参pGL3质粒PCR扩增；
[0015] (3)制作标准曲线：上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为 纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E = 10(_1/s)-l，计算扩增效率E;
[0016] (4)计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出 样本阈值Cq(T)和校对样本阈值Cq(C)，根据公式Q= (E+1) Λ Cq=[Cq(T)_Cq(C)]，得 出基因的校正起始拷贝数Q;将L0C284454的Q值与pGL3质粒的Q值的几何平均数相比，得到 L0C284454的相对表达量。
[0017] 通常在用实时定量PCR检测基因表达水平时，都要设置一个内参基因用作检测样 本的标准化，对于但目前尚无公认的血清标志物内参基因，我们创造性地在抽提血清核酸 时，定量掺入了人类基因组中所没有的一个无关质粒PGL3作为内参，用于定量和标准化。
[0018] 本发明利用无关质粒PGL3DNA对血清样本进行处理，得到的混合液直接用于逆转 录反应，解决了血清中无公认可靠的内参基因（管家基因）的问题。本发明根据公式E = 10 (一1/5)-1，计算扩增效率^)，根据公式(^=(5+丨）1'计算1^^284454基因相对质粒?61^3 DNA的表达量，避免了传统2_ △△ Gq法必须要求PCR扩增效率为100 %的限制，使结果分析更加 可靠。
[0019] 本发明通过实时荧光定量PCR技术验证了IncRNA L0C284454在鼻咽癌患者血清 (77例）和正常人血清（14例）中的表达情况;L0C284454在鼻咽癌患者血清中的表达比正常 人血清中显著提高。本发明为鼻咽癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。
【附图说明】
[0020] 图1为荧光定量PCR检测发现L0C284454在鼻咽癌中表达上调情况；
[0021 ] 实时荧光定量PCR技术验证IncRNA L0C284454在鼻咽癌(27例)和慢性炎症鼻咽上 皮组织(9例）中的表达情况，L0C284454表达显著上调(P = 0.0056);
[0022] 图2为L0C284454在鼻咽癌患者血清中同样表达上调情况；
[0023] 实时荧光定量PCR技术检测IncRNA L0C284454在鼻咽癌患者血清(77例）和正常人 血清（14例）中的表达情况;L0C284454在鼻咽癌患者血清中的表达比正常人血清中显著提 尚。
[0024]图3为原位杂交检测L0C284454在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0025] L0C284454在正常鼻咽上皮(NPE)中表达水平较低，40例正常鼻咽上皮中仅有6例 (15% )中检测到有L0C284454的低表达，在其余34例中检测不到；而在112例鼻咽癌组织中 有89例鼻咽癌（79.5%)中检测到有L0C284454的表达，其中71例为高表达，18例为低表达， 其余的23例鼻咽癌组织中未检测到L0C284454的表达;P〈0.001。
[0026]图4为鼻咽癌组织中L0C284454高表达患者预后差，更易复发和转移；
[0027] 鼻咽癌中L0C284454的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即L0C284454高表达 的患者总的生存时间（Over-all survival，0S)和无病生存时间（Deases-free sruvival， DFS)要明显低于L0C284454低表达或不表达的患者。L0C284454在鼻咽癌(NPC)中的表达与 患者复发(C)及远处转移(D)密切相关，L0C284454表达高的患者更容易复发，L0C284454远 处转移的能力更强。
[0028] 图5为在鼻咽癌细胞中导入L0C284454的干扰载体，可显著抑制L0C284454在鼻咽 癌细胞中的表达；
[0029] 在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2和HK1中导入靶向L0C284454的干扰载体（sh-l，sh-2， sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中L0C284454的表达情况，L0C284454的 表达均受到明显的抑制。阴性对照(NC)为Scramble干扰载体。
[0030] 图6为在鼻咽癌细胞中导入L0C284454的干扰载体抑制L0C284454表达后，细胞侵 袭能力降低；
[0031 ] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2和HK1中转入靶向 L0C284454的干扰载体，抑制L0C284454的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低。
[0032] 图7为在鼻咽癌细胞中导入L0C284454的干扰载体抑制L0C284454表达后，细胞迀 移能力降低；
[0033] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2和HK1中转入靶向L0C284454的干 扰载体，抑制L0C284454的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移速度明显减慢， 划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低。
[0034]图8为动物实验进一步证实干扰L0C284454的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力； [0035] 在鼻咽癌细胞5-8F中转入shRNA干扰载体抑制L0C284454表达后，经尾静脉将鼻咽 癌细胞注射到裸鼠体内，观察肺转移情况，发现与对照组(NC)相比，shRNA敲低L0C284454表 达的5-8F细胞肺转移灶的数目变少（图8A、C)，转移灶的体积变小（图8B、D)，P〈0.05，表明鼻 咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【具体实施方式】
[0036]以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0037] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测发现L0C284454在鼻咽癌中表达上调
[0038] 1.材料与方法：
[0039] 收集9例慢性鼻咽上皮组织和27例鼻咽癌组织，抽提总RNA，lyg RNA经逆转录成 cDNA后，进行实时荧光定量ΡΟ^υΧ284454正向引物为5'-TTCCTAGCAGCCAGTTACCC-3'如SEQ N0:2所示，和反向引物5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3 ' 如SEQ N0:3所示。
[0040] 用于对照的GAroH正向引物为5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 如SEQ N0:4所示，和 反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如SEQ N0:5所示。
[0041] 实时荧光定量PCR反应体系 SYBR? Premix Ex Taq? (2χ) 10μ1 PCR Forward Primer (1 Ομηι 0.4μ1 PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μL
[0042] eDNA 模板 2.0μΙ dtt20 7.2μ1 Total 20μ!
[0043] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0044] 1 94〇C 5min
[0045] 2 95〇C 10sec
[0046] 3 58〇C 30sec
[0047] 4 72〇C 20sec