[0048] 5 Plate read
[0049] 6 82〇C 30sec
[0050] 7 Plate read
[0051] 8 Go to step 2for more 39times
[0052] 9 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C,read every 0.2°C,hold for lsec
[0053] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算 P值。
[0054] 2.结果
[0055] L0C284454在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达P〈 0.001(图 1)
[0056] 实施例2,实时荧光定量PCR法检测证实L0C284454在鼻咽癌患者血清中表达上调
[0057] 1.材料与方法：
[0058] 使用BD 10ml血浆采集管(EDTA抗凝管)采集收集14例正常人和77例鼻咽癌患者静 脉空腹血约8ml，轻轻颠倒3次，lh内离心，X 160(^，1〇111；[11，4°0;冰上小心吸取上层血衆至新 的离心管，编号、标记，_80°C保存。
[0059] 血衆中抽提总RNA利用血衆核酸抽提试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Catalog no.55114，Qiagen公司）抽提，具体步骤如下：
[0060] (1)吸取300ul蛋白酶K至50ml离心管。
[0061] (2)加3ml血浆至离心管。
[0062] (3)加 2.4ml carrier-ACL mix至离心管，盖好管帽，祸旋振荡30s混勾。
[0063] (4)将离心管放到水浴箱中60°C孵育30min。
[0064] (5)从水浴箱中取出离心管，旋开管盖。加入5.4ml ACB缓冲液至离心管，关闭管 盖，涡旋震荡20s，充分混匀。
[0065] (6)将离心管置于冰上孵育lOmin。由于荧光实时定量PCR需要参照，血清循环RNA 检测过程中无公认可靠的内参基因（管家基因），因此我们选择往3ml血浆中加入lng无关质 粒pGL3 (购自Promega公司）作对照。
[0066] (7)采用真空抽吸方法纯化血清核酸(包括血清中的RNA及加入的pGL3质粒DNA): 组装好20ml延长管，mini柱和真空连接器，打开真空栗，待到全部裂解液通过mini柱(约10 分钟），关闭真空栗，将压力释放到〇,卸下并丢弃延长管。
[0067] (8)加600ul ACW1缓冲液到mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到ACW1完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第一遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0068] (9)加750ul ACW2缓冲液到mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到ACW2完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第二遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0069] (10)加750ul 100%乙醇至mini柱，维持mini柱盖子呈打开状态，打开真空栗，待 到乙醇完全通过mini柱，关闭真空栗，将压力释放到0。（第三遍洗涤，去除杂质，纯化mini膜 上的核酸）
[0070] (11)关闭mini柱的盖子，将mini柱卸下来，丢弃连接器，将mini柱放到干净的2ml 收集管，20，000x g离心3min。（去除残留的乙醇）
[0071] (12)将mini柱放到一个新的2ml收集管，打开管盖，放到水浴箱中56°C孵育10min， 直到mini膜完全干燥。将mini柱放到一个干净的1.5ml洗脱管，丢弃上一步的2ml收集管，加 入20ul AVE缓冲液(不含carrier RNA)至mini膜的中央，关上盖子，室温孵育3min。20，000x g离心lmin，洗脱纯化的核酸。
[0072] lyg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCLL0C284454正向引物为5'-ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 ' 如SEQ N0:6所示，和反向引物5 ' -ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3 ' 如 SEQN0:7**。
[0073] 用于对照的质粒pGL3正向引物为5'-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3'如SEQN0:8所示， 和反向引物5'-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3'，如SEQ N0:9所示。
[0074] 进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物以及PCR 反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq;同时，pGL3质粒DNA液10倍梯度稀释，作为校对样 本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参pGL3质粒PCR扩增;实时荧光定量PCR反应 体系 iTaqIY, Universal SYBRK Green Super Mix 5 μΙ PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.5μL PCR Reverse Primer (ΙΟμηι) (),5μ1
[0075] eDNA 模板 2.0μ1 dH20 2 μL Total 10 μΙ
[0076] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0077] 1 95〇C 30sec
[0078] 2 95〇C 5sec
[0079] 3 60°C 30sec
[0080] 4 Go to step 2for more 35times
[0081] 5 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C?read every 0.2°C?hold for lsec
[0082] 制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐 标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E = 10(_1/s)-l，计算扩增效率E;
[0083] 计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本 阈值Cq(T)和校对样本阈值Cq(C)，根据公式Q=(E+lΓ Λeq，ΛCq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因 的校正起始拷贝数Q;将L0C284454的Q值与pGL3质粒的Q值的几何平均数相比，得到 L0C284454的相对表达量，采用unpaired t-test检验计算P值。
[0084] 2.结果
[0085] L0C284454在正常人血清中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌患者血清中高表达P 〈0.001(图2)。
[0086]实施例3,原位杂交检测发现L0C284454在鼻咽癌中的表达与患者预后相关
[0087] 1.材料方法
[0088] 1.1设计并合成杂交探针
[0089]为了采用原位杂交方法检测L0C284454的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测L0C284454表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。
[0090]用于原位杂交检测L0C284454表达的寡核苷酸探针：
[0091 ] L0C284454探针1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' 如SEQ N0:10所 示，
[0092] L0C284454探针2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' 如SEQ NO: 11所 示，
[0093] L0C284454探针3:5'-GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3'如SEQ N0:12所 不。
[0094] 阳性对照探针(检测看家基因 GAPDH):
[0095] GAPDH探针1:5，-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3，，如SEQ N0:13所示，
[0096] GAPDH探针2:5，-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，，如SEQ N0:14所示，
[0097] GAPDH探针3:5，-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3，，如SEQN0:15所示。
[0098] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
[0099] 1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0100] 地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-P0D，Fab fragments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司），DAB染色试剂盒(北京中山公司），20x柠檬酸钠 缓冲溶液（saline sodium citrate，SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺 (Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸 (polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的娃精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t_RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x邓罕 氏缓冲液(Denhardts's solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白 (BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)，醋酸酐，阻 断试剂（Blocking reagent agent，Roche公司）。
[0101] 1.3其他主要试剂和材料
[0102] 无水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2~ 7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP〇4 4.3mmol/L，KH2P〇4 1.4mmol/L);3% 甲醇-双氧水溶液(80%甲醇和30%双氧水配置）；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer, CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时 配置后再校正工作液pH值）；0.1 %胰蛋白酶;苏木素；1 %盐酸酒精（1ml浓盐酸+99ml 70 % 酒精配置）；封片胶(PTS Cure Mountn );专用盖玻片(480X240mm2)定制于郑州玻璃仪器 厂。Leica低熔点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01m 〇l/L， pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。
[0103] 1.4标记探针
[0104] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如 下。
[0105] lOOpmol oligonucleotide+ddH2〇 = 9yl(control: control oligonucleutide 5μ l+ddH20 4μ1) Reaction buffer 4μ1 Coe 12 4μ1
[0106] Dig-dUTP ΙμL dATP ΙμL Terminal transferase 1 μL
[0107] 混匀，稍离心。37°C水浴反应30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。
[0108] 1.5寡核苷酸探针标记后纯化
[0109]为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[0110] 1)探针反应