br>[0193] 1.3 shRNA载体构建
[0194] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μΜ，互补单链各取10μ1混合。然后将oligo混合物在PCR仪中95 °C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。
[0195] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. lkb的载体片段，将退火后的粘性 末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接过夜。转 化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶切构建好的 pSUPER质粒，2 %的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的 阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内L0C284454的表达。
[0196] 1.4细胞培养与转染
[0197] 鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2和HK1购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0198] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5_8F、HNE2和HK1按2X 105个细胞/孔接种于6孔 板中，将6孔板置于37°C，5%⑶:^培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始shRNA 表达载体的转染;转染过程如下：
[0199] 在无菌EP管中加入3μ1的lipofectamine 3000于100μ1无血清培养基中混匀静置 5min；
[0200] 将构建的shRNA表达载体加入100μ1无血清培养基中；然后与上述包含 lipofectamine的100μ1无血清培养基温和混勾，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合 体；
[0201 ]用D-Hank ' s液洗涤细胞3次；
[0202] 将上述混合物中加入800μ1无血清培养基(无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的 1个孔；
[0203] 将6孔板置于⑶2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培 养48小时。
[0204] 1.5实时定量PCR检测shRNA干扰IncRNA表达的效果：
[0205] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2yg RNA经逆转录成cDNA后，进 行实时荧光定量PCRDL0C284454 引物为5 ' -TTCCTAGCAGCCAGTTACCC-3 '，和5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3,。
[0206] 用于对照的GAPDH 引物为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
[0207] 实时荧光定量PCR反应体系 SYBR? Premix Ex Taq? (2χ) 10μ1 PCR Forward Primer 0-Ομπι) 0.4μ1 PCR Reverse Primer (ΙΟμηι > 0.4μ1
[0208] eDNA 投板 2.0μΙ dH20 7.2μ1 Total 20μ!
[0209] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0210] 1 94〇C 5min
[0211] 2 95〇C lOsec
[0212] 3 58〇C 30sec
[0213] 4 72〇C 20sec
[0214] 5 Plate read
[0215] 6 82〇C 30sec
[0216] 7 Plate read
[0217] 8 Go to step 2for more 39times
[0218] 9 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C,read every 0.2°C,hold for lsec
[0219] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算 P值。
[0220] 2.结果
[0221] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞5_8F、HNE2和HK1后，均可显著下调鼻咽癌细胞 中L0C284454的表达水平（图5)。
[0222] 实施例5,制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中L0C284454的表 达
[0223] 1.材料方法
[0224] 1.1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
[0225]多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用0P10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行 娃纳米颗粒(silica nanoparticle，SiNP)的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和通过离子 静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒;所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：
[0226] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯（TE0S)，继续搅 拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干 燥，研细得硅纳米颗粒(SiNP)。其中H 20与0P-10及H20与TE0S的摩尔比为2~10、氨水浓度为 1.6~28%、TE0S在环己烷中的摩尔浓度为0.1~3mol/L。
[0227] 2)将SiNP按0.1~10mg/ml重悬于0.6M Na⑶3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再 将沉淀物按〇.1~1〇1^/1111重悬于?135(。!17.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸（终浓度为4~ 15nmol/mL)，充分混匀，室温混摇;离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修 饰的娃纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4~15nmo 1 /mL。
[0228] 1)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5~30 : 1与实施例3中所述的靶向 L0C284454的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。
[0229] 1.2细胞培养与转染
[0230] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和HK1按2X105个细胞/孔接种于6孔板 中，将6孔板置于37°C，5 % C02培养箱中，待培养细胞生长至50-70 %密度即可开始 L0C284454真核表达载体的转染;转染过程如下：
[0231] 在无菌EP管中加入100μΙ制备好的携带L0C284454真核表达质粒的多聚赖氨酸修 饰的硅纳米颗粒悬液，与1〇〇μ1无血清培养基温和混匀；用D-Hank ' s液洗涤细胞3次;将上述 混合物中加入800μ1无血清培养基(无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个孔;将6孔板 置于C0 2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用携带 Scramb 1 e序列的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0232] 1.3细胞穿膜实验
[0233] 细胞穿膜（（Transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1 %g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的上室 面，置37°C30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水化。
[0234] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1 X 105个转染了 L0C284454 shRNA干扰载体或对照载体(Scramble)的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加入含20 %胎 牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签 轻轻擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞。
[0235] 1.4细胞划痕实验
[0236] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了L0C284454 shRNA干 扰载体或对照载体（Scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用 200ul pipet在每个6孔板中划一条直线(划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各个时 间点（视不同细胞迀移能力而定)在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迀 移速度。
[0237] 2.结果
[0238] 2.1在鼻咽癌细胞中导入L0C284454的干扰载体抑制L0C284454后，细胞侵袭能力 降低
[0239] 细胞穿膜（Transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5_8F、HNE2和HK1中转入靶向 L0C284454的干扰载体，抑制L0C284454的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低（图6)。
[0240] 2.2在鼻咽癌细胞中导入1^^284454的干扰载体抑制1^^284454表达后，细胞迀移 能力降低
[0241 ] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2和HK1中转入靶向L0C284454的干 扰载体，抑制L0C284454的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢，划 痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图7)。
[0242] 实施例6,裸鼠转移瘤模型证实抑制L0C284454的表达可以抑制鼻咽癌细胞的转移 能力
[0243] 1.材料与方法
[0244] 10只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19 ± 2g，购买于上海斯莱克实验动物有限公 司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部于无特定病原体（SPF)条件下饲养。 L0C284454干扰载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实 施例4。转染L0C284454干扰载体或Scramble载体(NC)的5-8F细胞各取1 X 106个，经尾静脉 注入裸鼠体内（5只每组），10周后处死裸鼠，观察鼻咽癌细胞的转移情况(主要转移到裸鼠 肺中）。
[0245] 2.结果
[0246] 动物实验进一步证实干扰L0C284454的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力（图8)。 与对照组(NC)相比，敲低L0C284454的5-8F细胞肺转移灶的数目（图8六、(：少〈0.05)变少，转 移灶的体积变小（图8B、D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【主权项】
1.检测鼻咽癌患者血清中长链非编码RNA L0C284454表达量的试剂的应用，其特征在 于，所述的试剂用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂;该长链非编码RNA L0C284454 的序列如SEQ N0:1所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测制剂 为实时荧光定量检测试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于 实时荧光定量检测L0C284454表达的引物序列： 正向引物:5 ' -ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 '， 反向引物：5'-ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3'。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含 用于对照的检测荧光素酶基因的 正向引物为5'-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3' 反向引物5'-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3'。
【专利摘要】本发明公开了检测鼻咽癌患者血清中长链非编码RNA？LOC284454表达量的试剂的应用，主要是用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的实时荧光定量检测试剂。实时荧光定量PCR技术验证了lncRNA？LOC284454在鼻咽癌患者血清(77例)和正常人血清(14例)中的表达情况；LOC284454在鼻咽癌患者血清中的表达比正常人血清中显著提高。本发明为鼻咽癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483273
【申请号】CN201610066767
【发明人】曾朝阳, 李桂源, 熊炜, 李小玲, 唐艳艳, 杨丽婷, 孛昊, 李夏雨, 涂超峰, 綦鹏, 龚朝建, 张文玲
【申请人】中南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月29日