经工程改造以利用非常规氮源的微生物的制作方法
【专利说明】经工程改造w利用非常规氮源的微生物
[OOCM] 相关申请 本申请要求于2013年1月4日提交的美国临时专利申请顺序号61/748, 901和于2013 年3月14日提交的61/782, 351的优先权权益；运两者的内容通过引用结合到本文中。 [000引背景 在发酵工业，细胞培养基通常被配制为提供宿主细胞系生长所需的所有营养素，特别 强调的是满足细胞系对碳、氮、憐、硫和其它主要营养素的需要。一些细胞系需要额外成分， 包括氨基酸、痕量矿物质和金属、W及复杂的生长因子。运些营养素的存在为所选择的生物 体W及（遗憾的是）为任何可能污染的生物体，提供合适的生长环境。在该环境中，需要生 产生物体与细胞培养物中的任何污染生物体直接竞争。
[0003] 甚至在健壮的宿主中，培养物的机会性感染与由产品生产的需要所导致的代谢负 担的组合是单一培养操作中的主要问题。通常认为工业的稳健性是对宿主菌株具有特异性 并因此在发展过程的晚期难W可预见性地经工程改造到生物体中的多基因性状。选择性的 生长抑制剂例如细菌抗生素的添加，对于对生长抑制剂具有抗性的宿主生物体来说是用于 产生更稳健的发酵环境的一种方法。然而，抗生素的添加通常是不可取的或难W实施的，并 且自发抗性污染频繁产生。
[0004] 因此，需要经合理地工程改造的性状，当经工程改造到宿主生物体时，其产生稳健 的单一培养发酵环境。
[000引发明概述 在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改造 的生物体已被包含任一种或多种本文公开的序列的核酸分子转化。
[0006] 在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程 改造的生物体已被核酸分子转化；所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因编码 选自W下的非天然酶：脈基甲酸水解酶、双缩脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解酶、鸟嚷岭 脱氨酶、Ξ聚氯胺脱氨酶、异丙基Ξ聚氯酸一酷胺异丙基氨基水解酶、氨腊水合酶、脈酶和 脈簇化酶。
[0007] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的式Ι-ΙΠ的任一个的含氮化合物 或其盐； 与所述经基因工程改造的生物体相同物种的天然生物体不能代谢（即，用作氮源）所 述含氮化合物； 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物；和 式I化合物是
其中，每次出现时独立地，
遥5-、6-、9-或10-元芳基或杂芳基； R是-OH、-%H、-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基讯η是 0、1、2、3、4 或 5 ; 式II化合物是
II 其中，每次出现时独立地， X是-畑-、-Ν(烷基）-、-〇-、-C脚)厂、-S-或不存在； Υ是-Η、-畑2、-Ν(Η)(烷基）、-Ν(烷基）2、-COzH、-CN或取代的或未取代的烷基；和Ri是-H、-OH、-C02山-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基讯 式III化合物是
III 其中，每次出现时独立地， Y是-H、-畑2、-N(H)(烷基）、-N(烷基）2、-C02H、-CN或取代的或未取代的烷基。
[0008] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的选自W下的含氮化合物：Ξ嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二 亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和 脈基甲酸（alio地ante);和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0009] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分基本上由选自W下的含氮化合物组成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯 基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基 四胺、1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和脈基甲酸；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0010] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物由含氮部分和不含氮部分组成； 所述含氮部分由选自W下的含氮化合物组成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基四胺、 1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和脈基甲酸；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0011] 在某些实施方案中，本发明设及通过任一种上述方法制备的产物。
[0012] 在某些实施方案中，本发明设及包含与启动子操作性连接的基因的重组载体，其 中所述基因编码酶；和所述酶是脈基甲酸水解酶、双缩脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解 酶、鸟嚷岭脱氨酶、Ξ聚氯胺脱氨酶、异丙基Ξ聚氯酸一酷胺异丙基氨基水解酶、氨腊水合 酶、脈酶或脈簇化酶。
[0013] 附图简述 图1描绘了Ξ聚氯胺降解途径的示意图。1 -Ξ聚氯胺脱氨酶（tzrA)(EC3. 5. 4.-); 2 -Ξ聚氯酸二酷胺脱氨酶（鸟嚷岭脱氨酶）巧C3. 5.4.3) ;3 -N-异丙基Ξ聚氯酸 一酷胺异丙基氨基（Ξ聚氯酸一酷胺）水解酶巧C3. 5. 99. 4) ;4 -Ξ聚氯酸水解酶巧C 3. 5. 2.15) ;4a-簇基双缩脈脱簇酶，自发反应；5 -双缩脈酷胺水解酶巧C3. 5. 1.84); 6 -脈基甲酸水解酶巧C3. 5. 1.54)。氮可W通过作用于Ξ聚氯胺的完整途径的作用被同 化（作为畑3)，释放6molNVmol^聚氯胺，或经由作用于途径的中间体的酶的亚类（例 如，作用于Ξ聚氯酸的步骤4、4a、5和6,释放3molNHs/molS聚氯酸）。
[0014] 图2列表显示能够递送可被工程化生物体利用的氮的示例性化合物。
[001引图3列表显不编码二聚氛胺降解途径的DNA和蛋白序列。
[0016] 图4描绘了氨腊同化途径的示意图。氨腊水合酶巧C4. 2. 1. 69)将氨腊转化为 脈后，可经由脈酶巧C3. 5. 1.5)或通过脈簇化酶巧C6. 3. 4.6)和脈基甲酸水解酶巧C 3. 5. 1. 54)将脈降解。
[0017] 图5-10描绘了本发明的多种质粒。
[0018] 图11列表显示用于实施例9的MOPS培养基中的成分浓度。
[0019] 图12描绘了在含有不同浓度的锭离子或Ξ聚氯胺的培养基中的NS88和NS91 (对 照）的生长进程。
[0020] 图13描绘了在含有不同浓度的锭离子或双缩脈的培养基中的NS90和NS91 (对 照）的生长进程。
[0021]图14描绘了在具有不同氮源的MOPS培养基中生长的培养物在48h后拍摄的图 像。从左到右：NS88,用10mMS聚氯胺；NS91，用10mMS聚氯胺；NS90,用10ml双缩脈 (重复1) ;NS90,用10ml双缩脈（重复。；和NS91，用10ml双缩脈。
[0022] 图15描绘了本发明的质粒。
[0023] 图16描绘了本发明的质粒。
[0024] 图17描绘了在含有无氮源、脈或氨腊的培养基中的NS100 (对照）和NS101的生 长进程。
[00幼图18描绘了在含脈培养基中的NS100 (对照）和NS101的群体分数。
[0026] 图19描绘了在含氨腊培养基中的NS100 (对照）和NS101的群体分数。
[0027]图20描绘了在不含氮源的培养基、或含氨腊的培养基中的NS100 (对照）和 NS101的生长进程。
[0028]图21描绘了在不同含氮培养基上，在抗生素存在下，本发明生物体的生长（对于 SC氨基酸培养基的组成，参见图33)。
[0029] 图22列表显示本发明的4种生物体在不同培养基上生长后，在600nm处的光密 度。
[0030] 图23列表显示本发明的3种生物体在不同培养基上生长后，在600nm处的光密 度。
[003。图24描绘了相比天然生物体在畑斜上的标准曲线，本发明的4种生物体（NS91 =对照）在0.25mlΞ聚氯胺上的生长。因为Ξ聚氯胺具有6个氮原子，有能力利用Ξ聚 氯胺的生物体的效率应当高约6倍（参见例如，与在1.5mlNH4CI上的天然生物体相比， 在0. 25mlΞ聚氯胺上的NS110)。
[003引图25描绘了相比天然生物体在畑典1上的标准曲线，本发明的4种生物体（NS91=对照）在0.25 ml Ξ聚氯酸二酷胺上的生长。因为Ξ聚氯酸二酷胺具有5个氮原子，有能 力利用Ξ聚氯胺的生物体的效率应当高约5倍（参见例如，与在1. 25 ml NH4CI上的天然 生物体相比，在0. 25 ml Ξ聚氯酸二酷胺上的NS110)。
[003引 图26描绘了本发明的不同生物体在0. 5 ml NH4CI上的生长。重要的是，图26-28 中描述的生物体例如NS120、NS91、NS107和NS123是衍生自大肠杆菌化coii) K12、大肠 杆菌B、大肠杆菌化ooks和大肠杆菌MG1655的大肠杆菌菌株和意图显示本发明跨越大肠杆 菌不同菌株的宽度。
[0034]图27描绘了本发明的不同生物体在不含氮的培养基上的生长。
[0035] 图28描绘了本发明的不同生物体在含有0.5mMS聚氯胺的培养基上的生长。
[0036] 图29列表显示本发明的不同质粒的概述。
[0037] 图30列表显示本发明的不同生物体的概述。
[0038] 图31列表显示MOPS限定培养基中的成分和各成分的摩尔浓度，其用于例如大肠 杆菌。
[0039] 图32列表显示YNB培养基中的成分和各成分的重量浓度，其用于例如酿酒酵母 (S.cerevisiaS)。
[0040] 图33列表显示SC氨基酸培养基中的成分和各成分的重量浓度。
[00川发明详述 概沐 在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的宿主生物体，其中所述经基因工程 改造的宿主生物体具有从复杂底物获得生长限制性营养素的非天然能力；而天然宿主生物 体不能代谢该复杂底物或将其用作营养素。在某些实施方案中，所述非天然能力将为生物 体提供明显的竞争优势，并且对发酵中污染物的成功提供主要障碍。在某些实施方案中，所 述经基因工程改造的宿主生物体是细菌、酵母、真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。在某些实 施方案中，所述经基因工程改造的宿主生物体是细菌或酵母。
[0042] 在某些实施方案中，本发明设及使用上述经基因工程改造的宿主生物体的方法， 包括使所述经基因工程改造的宿主生物体接触经改良的细胞培养基。在某些实施方案中， 本发明设及使用上述经基因工程改造的宿主生物体的方法，包括使所述经基因工程改造的 宿主生物体接触经改良的细胞培养基，其中所述经基因工程改造的宿主生物体将细胞培养 基转化为产物。在某些实施方案中，使用该方法提供独特和祀向方式W促进所需经基因工 程改造的宿主生物体的生长。在某些实施方案中，上述方法使污染生物体的生长减到最小， 提供有价值的竞争优势，并允许控制一系列有价值产物的生产。
[0043]在某些实施方案中，本发明的方法减少或消除了对在大规模酵母培养中使用预防 性的抗生素的需要。因新出现的环境考虑和社会压力所致，避免不必要的抗生素具有重要 的利益。另外，在某些实施方案中，所述技术可W应用于细菌系统，其中可W不添加抗生素。
[0044] 在某些实施方案中，所述经基因工程改造的宿主生物体是酵母；和所述产物是乙 醇、异下醇、乳酸、异戊二締类、脂质和酶产物、或高价值的专业化学品。
[0045] 在某些实施方案中，所述经基因工程改造的宿主生物体是细菌；和所述产物是下 醇、乙醇、异丙醇、1，3-丙二醇（PD0)、1，4-下二醇度DO)、班巧酸、衣康酸、酶产物、多元醇、 蛋白质产物或高价值的专业化学品。
[0046] 在某些实施方案中，本发明的技术可用于产生一种或多种日用品、精细化学品和 药品。
[0047] 定父 "干重"和"干细胞重"是指相对缺水时所测的重量。例如，对于油质的细胞，当包含指 定百分率的特定成分的干重时，是指该百分率是根据已基本除去所有水后的细胞重量而计 算。
[004引"外源基因"是已引入细胞中（例如通过转化/转染）的编码RNA和/或蛋白表达 的核酸，并且也称为"转基因"。包含外源基因的细胞可W称为重组细胞，其中可引入另外的 外源基因。相对于所转化的细胞而言，外源基因可W来自不同物种（并因此是异源的），或 来自相同物种（并因此是同源的）。因此，外源基因可包括同源基因，相对于基因的内源拷 贝而言，其占据细胞基因组的不同位置或处于不同控制之下。外源基因在细胞中可存在着 不止一个拷贝。外源基因可W作为基因组（核或质体）的插入物或作为附加体分子而维持 在细胞中。
[0049] "表达载体"或"表达构建体"或"质粒"或"重组DNA构建体"是将核酸引入宿主 细胞的媒介。核酸可W是经由人类干预（包括重组方式或直接化学合成）而产生的核酸， 具有一系列指定的核酸组件，其允许特定的核酸转