专利名称:一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法，属于发酵工程技术领域：
。本发明还涉及上述方法在发酵法生产丙酮酸的应用，属于发酵工程领域。
背景技术：
丙酮酸又称2-氧代丙酸O-Oxopropanic acid)、α -酮基丙酸 (a -Ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快的酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是合成多巴胺、L-酪氨酸等多种有用化合物的前体。因此，它在制药、日用化工、农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。
自从20世纪50年代开始发酵法生产丙酮酸以来，国内外研究人员对丙酮酸生物合成的研究越来越深入，涉及菌种选育、营养条件、维生素、溶氧水平、温度控制、耐高渗和耐酸性等各个方面。为了达到丙酮酸高产量、高产率和高生产强度的相对统一，研究者又通过分子手段引入外源代谢途径，从辅因子工程方面入手研究了丙酮酸生物合成中的能量代谢，并对糖酵解作用作了一些有益的研究，研究者还在菌株耐高渗和耐酸方面也作了一些探索。但是在不同氮源的利用水平尤其是尿素对丙酮酸生产的影响方面鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法和本方法在工业生产中的应用。利用本发明能够提高丙酮酸发酵的产量和发酵生产强度。
本发明的技术方案一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法和应用，以多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，利用尿素代替氯化铵作为唯一氮源，初始添加量为7g/L，在实验室规模7L发酵罐分批发酵培养，且在30L发酵罐上进行了中试。
菌种光滑球拟酵母(T. glabrata)CCTCC M202019，硫胺素、烟酸、生物素和吡哆醇四重维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育，主要用来发酵生产丙酮酸，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142. 2，公开号为CN1392M6A。
本发明的有益效果利用本发明能够有效提高丙酮酸的产量及生产强度，大幅缩短发酵周期丙酮酸产量由79. 7g/L提高至88. 7g/L，提高幅度为11.3%，发酵周期由8 缩短至72h，幅度为15. 3%，从而发酵生产强度由0. 94g/(L-h)提高至1. 23g/(L *h)，幅度为30.9%。优化后的结果在30L规模发酵罐得到验证。
本发明通过提供一种利用尿素作为氮源的策略，提高发酵法生产丙酮酸产量和生产强度。这对发酵法生产其他产品具有一定的指导意义。
具体实施方式
[0009]对照实施例本发明所用菌种为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019。
先转接斜面在培养箱中30°C培养Mh，每只摇瓶(50/500mL)接一环斜面菌种，在温度30°C，转速200rpm条件下培养Mh ；最后在7L发酵罐中发酵，发酵条件为pH 5. 5，搅拌转速400rpm，通气2. Ovvm。
斜面种子固体培养基(g/L)
葡萄糖30，大豆蛋白胨 10，KH2PO4 1，MgSO4 · 7H20 0. 5，琼脂粉 20g，用 6mol/L HCl 调节培养基初始PH为5. 5。自来水定容。于121°C灭菌15min。
种子培养基(g/L)
葡萄糖30，大豆蛋白胨 10，KH2PO4 1，MgSO4 · 7H20 0. 5，用 6mol/L HCl 调节培养基初始PH为5. 5。自来水定容。
发酵培养基(g/L)
葡萄糖120，尿素 7，CH3COONa 3，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 0. 8，L-谷氨酸 0. 8，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH5. 5。自来水定容。
微量元素液MnCl2· 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g，ZnCl2 0. 5g，溶解后定容至 IL0
维生素液盐酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g，盐酸吡哆醇0. 04g，烟酸0. 8g， 6mol/LHCl溶解后定容至1L。
实施例1 发酵条件同对照例，将发酵培养基中氮源改为氯化铵和尿素两种复合氮源，氯化铵尿素(1 1)为6.2 3.5g/L，复合氮源中含氮量与7g/L尿素含氮量相当。
发现①菌体生长加快，发酵7 时菌体干重为16. 5g/L ；提高了(15. 9g/L) 2. 5%； ②发酵进行到72h时，菌体耗糖速度提高了 13. 1 % ；③发酵周期从8 缩短至79h，幅度为 7. 1%;④发酵结束时，最高丙酮酸浓度为82. lg/L，提高3. 0%;⑤丙酮酸发酵生产强度提高 10. 6%。
实施例2 发酵条件同对照例，将发酵培养基中氮源改为尿素，尿素添加量为7g/ L0
发现①菌体生长加快，发酵72h时菌体干重为17.8g/L;提高了(15. 9g/ L)11.9% ；②发酵进行到72h时，菌体耗糖速度提高了 20.2% ；③发酵周期从8 缩短至 72h，幅度为15. 3% ；④发酵结束时，最高丙酮酸浓度为88. 7g/L，提高11. 3% ；⑤发酵结束时丙酮酸生产强度提高30. 9 %。
权利要求
1.一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法，其特征是以多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，利用尿素代替氯化铵作为唯一氮源，在实验室规模7L发酵罐进行分批发酵培养60h，并在30L发酵罐中进行中试；发酵培养基(g/L)葡萄糖 120，尿素 7，CH3COONa 3，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 0. 8，L-谷氨酸 0. 8，微量元素液10mL，维生素液IOmL, pH 5. 5，自来水定容；微量元素液=MnCl2 · 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g, ZnCl2O. 5g，溶解后定容至IL ；维生素液盐酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g，盐酸吡哆醇0. 04g，烟酸0. 8g，6mol/ LHCl溶解后定容至1L。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于控制尿素初始添加量为7g/L，通气量为 2vvm，硫胺素添加量为15 μ g/L，最大菌体浓度OD66tl达到61。
专利摘要
本发明公布了一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法，属于发酵工程技术领域：
。本发明通过以多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019为生产菌株，利用尿素代替氯化铵作为唯一氮源，初始添加量为7g/L，在实验室规模7L发酵罐分批发酵培养。本发明有效提高丙酮酸的产量(11.9％)及生产强度(30.9％)，大幅缩短发酵周期(20.6％)，上述成果在30L规模发酵罐中成功进行了中试，具有广阔的工业化应用前景。
文档编号C12P7/40GKCN102286550SQ201110166742
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月21日
发明者刘立明, 杨松鑫, 汪军, 陈修来, 陈坚 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan