专利名称：水解氮源的制作方法
技术领域：
此项发明是通过向发酵培养基中加入一种或几种部分预水解复合氮源的方法，以更经济的方式发酵生产所需酶。
背景技术：
用于工业化发酵生产有用化合物的培养基，其中通常含有如大豆、玉米浆、酵母提取物等传统氮源。但使用这些传统氮源有许多缺点，如在加热灭菌时粘度高、原材料改变、酶难于复性回收、产生有色副产物等。而且这些传统氮源的成本昂贵，或消耗得过快。
可以最低培养基代替传统氮源，例如WO 98/37179中所述方法就是一例，但这一方法的缺点是菌体生长缓慢且酶产量低。
而在WO 01/05997中描述了用含有水解大豆蛋白的培养基生产破伤风毒素，发明者在67页中所述，将葡萄糖与剩余的培养基一起高压灭菌将有利于菌体的生长和毒素的产生。
发明概要发明者发现，为了确保氨基酸/肽利于微生物菌株的快速生长和/或保证所需产物的高产量，就需要在发酵培养基中加入部分预水解的复合氮源，所以我们希望保护一种工业化生产酶的方法，包括a)利用微生物发酵生产相关酶时，发酵培养基中含有一种或几种预水解的复合氮源，其中这些部分预水解的氮源应该与任何其它碳水化合物源分开灭菌，复合氮源的预水解可通过向其加入酸和/或水解酶的方式来达到。以及
b)从发酵培养基中回收所需酶。
发明详述微生物菌种此发明中所用的微生物菌种可以是任何种属的微生物。
优选可以用细菌或真菌来生产相关酶。
例如，可以用某些革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌，如嗜碱芽胞杆菌、如解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、缓慢芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属，如浅青紫链霉菌、鼠灰链霉菌等；此外也可利用诸如大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。
同样也可以通过真菌获得相关酶，如假丝酵母属、卡氏酵母(Kluyveromyces)属、毕赤酵母属、糖酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia属，例如卡尔酵母、啤酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维氏酵母、诺地酵母或Saccharomyces oviformis等利用一些丝状真菌也可以产生所需要的酶。这些丝状真菌包括顶孢霉属(Acremonium)，曲霉菌属，桃木属(Aureobasidium)，隐球菌属，镰刀菌属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉菌属，毁丝霉属，Neocallimastix，脉孢菌属，拟青霉菌属，青霉菌属，瘤胃真菌属(Piromyces)，裂褶菌属，Talaromyce嗜热子囊菌属，梭孢壳属，Tolypocladium属，木霉属等，具体地，酶可得自棘孢曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，黍镰刀菌，黄色镰刀菌，禾谷镰刀菌，穗枯镰刀菌，尖孢镰刀菌，粉红镰刀菌，接骨木镰刀菌，硫色镰刀菌，香蕉镰刀菌，镰孢菌，脉孢菌，米赫根毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌，木素木霉菌，康宁木霉菌，长枝木霉菌，里氏木霉菌，绿色木霉菌等。
以上所涉及的所有菌种都可以在公共的微生物收集中心获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培植中心(DSM)、荷兰真菌酵母收集中心(CBS)和农业研究服务培育和收集中心，美国农业研究菌种保藏中心北部地区研究服务中心(NRRL)。
总之，为了应用此发明生产所需的酶，在这里所用的术语“从……获取”是与所给源相关联的，这就表示相关酶是插入了源的基因的细胞所产生的。
相关酶相关的酶可能是某个肽段或某种酶。
对本文来说首选含有5到100个氨基酸的肽段(peptide)；含有10到80个氨基酸、15到60个氨基酸、15到40个氨基酸的肽段则依次更佳。
具体来说，这种方法需要应用到酶，特别是水解酶(酶命名法即EC3类；根据国际生物化学联盟命名委员会推荐)。
更为具体的说推荐以下水解酶蛋白酶适合的蛋白酶来源于包括动物、植物或者微生物。微生物来源的蛋白酶更佳，包括经化学修饰过或经蛋白工程突变的蛋白酶。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属酶，最好是微生物来源的碱性蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶(类胰蛋白酶trypsin-like protease)。
蛋白酶和肽酶分别根据在细胞中的酶活性＞＝或＜10％被定义为自我破坏性和非破坏性，细胞培养在无细胞肉汤培养物中，培养时间为24小时，发酵过程中无细胞肉汤培养物酸碱度和温度值的选择按照一定数值，这些值是发酵过程中从收获前24小时到收获时有代表性的酸碱度和温度范围。
无细胞肉汤培养物由肉汤经过过滤、离心或类似程序分离而由肉汤溶液中的非溶质(包括细胞)得到。
碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，特别是那些起源于芽孢杆状菌的酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中述及)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和镰刀霉蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中述及。
可用的蛋白酶的例子是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中述及的变体，尤其是替换了以下一个或多个位点的27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
可用的较好的商品蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(诺维信A/S)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECTOXPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor国际公司)。
肽酶适合的肽酶例如FLAVOURZYMETM(诺维信A/S)。
脂肪酶脂肪酶包括来源于细菌或真菌，亦包括来源于经化学修饰的突变体及经蛋白质工程改造的突变体。脂肪酶可产自腐质菌属(又名嗜热真菌属)如棉状嗜热丝孢菌或腐质霉(EP 258 068 and EP 305 216)；假单孢菌属如产碱假单孢菌(WO 96/13580)；类产碱假单孢菌如洋葱假单孢菌(EP331 376)、斯氏假单孢菌(GB 1,372,034)、荧光假单孢菌、假单孢菌属(WO95/06720和WO 96/27002)以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)等。
其它例子是脂肪酶变异物，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的。
可用的较好的商品脂肪酶有LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(诺维信A/S)。
淀粉酶适合的淀粉酶(α和/或β)包括来源于细菌或真菌的。亦包括经化学修饰过或经蛋白工程突变的。例如淀粉酶有从芽孢杆菌中取得的α-淀粉酶，还有一种特殊种类的地衣芽孢杆菌，详见GB 1,296,839。
可用的淀粉酶的例子见于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424所描述的变体，尤其是那些替换了以下一个或多个位点的15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
可用的商品淀粉酶包括DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYLLCTM、TERMAMYLSCTM、LIQUIZYME-XTM、BANTM(产自诺维信A/S公司)，RAPIDASETM和PURASTARTM(产自Genencor国际有限公司)。
纤维素酶适用于该用途的纤维素酶包括细菌或真菌来源，包括野生型的和经化学诱变或蛋白质工程突体，如细菌、假单胞菌、腐质霉(Humicola)、镰刀菌、梭孢菌(Thielavia)、直枝顶孢霉菌等。例如US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259的Humicola insolens、Myceliophthora thermophila、Fusarium oxysporum制备的纤维素酶。
尤为适用的纤维素酶是那些显色优势的碱性或中性纤维素酶，包括专利号为EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO98/08940的纤维素酶。其它包括WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299等纤维素酶变体也很适用。
可用的商品纤维素酶包括了诺维信A/S公司的CELLUZYMETM和CAREZYMETM，Genencor国际有限公司的CLAZINASETM和PURADAXHATM以及Kao公司的KAC-500(B)TM等产品。
氧化还原酶本发明可用的氧化还原酶包括过氧化物酶，氧化酶，如漆酶、过氧化氢酶。
其它优选的水解酶是碳水化合物水解酶，包括诺维信A/S公司的MANNAWAYTM和果胶酸裂解酶(例如BIOPREPARATION 3000TM)。此外首选的酶类还有转移酶、裂解酶、异构酶、连接酶。
复合氮源按照本发明要求，合适的复合氮源是动植物来源的蛋白质，尤其是那些碳水化合物含量在10％以内的蛋白质，如果碳水化合物含量在5％甚至是3％以内将更好。
碳水化合物含量低的好处就在于可以避免梅拉德氏反应(Maillardreactions)。通常在对含有伯胺基化合物和还原性碳水化合物的培养基经行加热灭菌时，颜色的形成(梅拉德氏反应)极度不利于回收和/或可能抑制生长。因此在加热灭菌时将梅拉德氏反应“参与物”分开控制在一定的范围内将显得十分重要。这就是说将诸如葡萄糖、蔗糖等简单的碳水化合物与复合氮源分开灭菌是很有必要的，而且复合氮源最好是那些碳水化合物含量较低的蛋白质，如马铃薯蛋白质、豆角蛋白质、血液蛋白质、鱼类蛋白质和其它动物蛋白质。
然而，精通此领域的人必然知道在复合氮源灭菌时，少量碳水化合物对酶类的回收和生长没有大的影响。因此，在将碳水化合物和复合氮源分开灭菌时，在复合氮源中可以加入少于10％的碳水化合物。
熟悉此领域的人们知道加热灭菌对有可能发生梅拉德氏反应的培养基中的还原性碳水化合物数量的影响随规模而不同。所以，是否选择了合适的复合氮源以及合适的氮源预水解条件应当按照生产规模进行评价。
通常加入发酵培养基中预水解的复合氮源至少应该是凯氏定氮法(N-Kjeldahl)氮量的5％(质量比)，具体应该是10-75％(质量比)。
预水解复合氮源的酶预水解是首选的技术，但是这项发明也可以用酸水解这样的技术来完成。
举例说明预水解过程的最优方案的表现。
预水解的需要程度能够尽可能地通过正确地调整水解作用温度，加入的蛋白酶和/或者肽酶的数量，考虑预水解发生的时间，在预水解过程中水解酶的选择以及预水解发生时在选择了水解酶的前提下选择适当pH值间隔来实现。
需要的预水解程度将取决于几个因素根据从得到高浓度和高体积产品生产能力的观点来看，高度浓缩的进料培养基有着潜在的优势。因此，为了刺激生物量的形成和/或者产品的形成，如果有足够数量的易利用的复合氮源——逐渐在整个发酵期间——可由接种前存在于发酵罐中的现成培养基中的不易于获得的复合N-源制备得到，要避免加入经过分别消毒的复合氮源到这种进料培养基中。达到易利用复合氮源的持续可获得性是进行预水解的目标，它能根据达到的水解程度和在培养过程中菌株所产生蛋白酶和/或者肽酶数量来进行调节。
根据取得高特定产品的生产能力——即，单个的活细胞的高产品生产速度也能应用类似的讨论。
从取得高效产品的生产能力来看，当产品是一种在单分子或者双分子反应中使自己失活的酶，添加培养基成分以免使产品自身失活是非常有利的。当加入这样的培养基成分到发酵肉汤中时复合氮源可以是这样的培养基成分。因此，可以发现，添加这样的培养基成分到培养基中是非常有利的——尤其是当该培养基成分水解到一定程度，可以用大型泵抽送，同时仍然保持高度的保护作用时。
术语“可以用泵抽送的”是用来描述某种固体颗粒的悬浮态。这些固体颗粒在泵、阀门和管道系统中却很少成块状——团块的存在能改变供料速度超过5％。
如果相关的酶是一种淀粉酶，一种纤维素酶，脂肪酶，一种氧化还原酶，一种碳水解酶或者是一种无破坏性的蛋白酶或肽酶，预水解优选引起肽键10-70％的破坏，更优选的来说是在肽键的15-40％之间。
如果相关的酶是一种具有自我破坏能力的蛋白酶或者肽酶，预水解优选破坏肽键含量的1-20％，更易破坏的是肽键的2-10％。
如果相关的酶是一种具有自我破坏能力的蛋白酶或者肽酶，作为一种复合氮源，它在利用高度水解蛋白和仅仅轻微水解蛋白的混合物时具有特殊优势。预水解的程度对产生相关的酶，加入复合氮源的数量在以上都得以表述，可以按照下列式子进行计算[DPH(高度水解)×W(高度水解)+DPH(轻微水解)×W(轻微水解)]/[W(高度水解)+W(轻微水解)]；其中DPH(高度水解)是指高度水解蛋白的预水解的程度DPH(轻微水解)是指轻微水解蛋白的预水解程度W(轻微水解)是指在介质中轻微水解蛋白的重量W(高度水解)是指在介质中高度水解蛋白的重量发酵此项发明可以用于任何符合工业生产标准的发酵过程。例如可以满足发酵培养基体积至少是50升、100升、500升、1000升甚至是5000升的不同要求。
这些微生物菌种都可以按照现有的任何方法来发酵。发酵培养基可以是由复合氮源和复合碳源混合而成的培养基。发酵过程可以是分批式发酵、重复分批式发酵、流加分批式发酵、重复流加式发酵或者是连续式发酵过程。
在流加分批式发酵过程中，发酵前通常不向培养基中加入或只部分加入那些包含结构和/或催化元件。在发酵反应的过程中才加入全部或其他的包含结构和/或催化元件。选择进料的化合物可以一起或分开加入。
在重复流加分批式发酵或连续式发酵过程中，在发酵过程中另外加入全部的起始培养基成分。起始培养基可以与结构单元进料一起或分开加入。不同的是，在重复流加分批式发酵过程中，每隔一段时间，定期地去除含有生物量的培养物。而在连续式发酵过程中，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基的同时，含有生物量的培养物也以相同的速度连续从反应器流出。这两种方式都是通过在加入一定量新鲜培养基的同时从中取出同等量的培养物，来保持培养体积的恒定。
在此项发明中，可以采用流加分批式发酵、重复流加分批式发酵或连续式发酵三种方式是优选的。
有用化合物的回收该发明进一步涉及到发酵肉汤的处理。发酵反应结束后，相关酶应当根据各自不同的特点采用不同的标准技术从发酵肉汤中回收。
以下是几个产物回收的例子，但该发明并不仅仅局限于下面所举例子。
例一马铃薯蛋白的水解OPA＝51％向3.2千克马铃薯中加自来水至12.5升，搅拌使马铃薯蛋白充分悬浮。
在混匀的同时对其加热，温度设定在54摄氏度。
当温度达到45摄氏度时，用4N的氢氧化钠溶液将pH值调至6.0。
当温度到达50摄氏度时，向其中加入80毫升的ALCALASETM2.4L FG(购自诺维信A/S公司)，但在此之前一定要确保用4N的NaOH将pH值维持在6.0。
大约5分种后，温度升至54摄氏度。
在加入ALCALASETM大约10分种后设定pH值由6.0至8.0。在ALCALASETM加入又26分种后，停止滴加4N的氢氧化钠溶液，向其加入1.6千克的马铃薯蛋白。
充分混匀，将马铃薯蛋白充分悬浮3分种，加入150毫升FLAVOURZYMETM(购自诺维信A/S公司)。
在加入ALCALASE 20小时后，加水至总体积为16升，将这16升含有预水解蛋白的悬浮液分装为份，每份4升，立即放置于-18摄氏度保存，此时蛋白预水解过程已停止。
怎样定义蛋白预水解程度(OPA)将在例四中解释。该例假设马铃薯蛋白质中干物质含量为93％，其中蛋白质的％含量为干物质的80％。
例二马铃薯蛋白质的水解(OPA＝2.9％)称取2.09千克马铃薯蛋白加自来水至10.5升，将其搅拌使马铃薯蛋白能够充分悬浮。
混匀的同时对其加热(温度设定在55摄氏度)。
当温度到达30摄氏度时，向其加入4N的氢氧化钠溶液将pH值调到6.2。
在温度达到55摄氏度时，向其加入58.5毫升ALCALASETM2.4LFG，并通过加入4N的氢氧化钠溶液保持pH值在6.2不变。
从加入ALCALASE时起，5分种后其pH设定值由6.2变为8.0。
再经过30分种后加入15％的磷酸溶液(H3PO4)在5分种内将pH值由8.0降低到5.6，在加入1.575千克的马铃薯蛋白。
然后立即加自来水至15升，将这些含有水解蛋白的悬浮液按每份2升分装，储存于-18摄氏度保存待用，此时水解过程已停止。
蛋白预水解程度(OPA)将在例四中解释。假设马铃薯蛋白质中干物质含量为93％，其中蛋白质的％含量为干物质的80％。
例三马铃薯蛋白质的水解(OPA＝19.5％)称取1.2千克马铃著蛋白加自来水至13升，将其混匀使马铃薯蛋白能够充分悬浮。
混匀的同时对其加热(设定55摄氏度)。
当温度到达55摄氏度时，通过向其加入4N的氢氧化钠溶液使其pH值调至7.0，加入116.6克ALCALASETM2.4L FG并不断的向其滴加4N的氢氧化钠溶液保持pH值在7.0不变。
从加入ALCALASE时算起，4小时后加自来水至16升，将这些含有与水解蛋白的悬浮液按每份4升分装，储存于-18摄氏度保存待用，此时水解过程已停止。
蛋白水解的程度(OPA)是怎样定义的将在例四中解释。假设马铃薯蛋白质中干物质含量为93％，其中蛋白质的％含量为干物质的80％。
例四OPA的解析，蛋白水解程度将大约1克样品(样品重量W1)与4毫升0.1N的氢氧化钠溶液混合。
离心混合物至上清液澄清，用适当量的去离子水稀释上清液至V1毫升。
时间起点加入3毫升OPA反应试剂(见下)，剧烈混匀。两分钟后(这一时间要相当精确)，测340纳米下的吸光值(1cm cuvette)。
将每个样品都按同样的方式平行处理两次。
平均吸光值应该在对照吸光值和标准吸光值之间，否则就要根据结果重新将样品稀释。
对照吸光值(blind)去离子水的吸光值标准吸光值向50毫克L-亮氨酸加入500毫升去离子水后的吸光值OPA反应试剂称取7.62克四硼酸二钠，200毫克十二烷基磺酸钠加入去离子水大约至175毫升。向4毫升96％乙醇中加入160毫克OPA，并使OPA充分溶解。然后将上述两种溶液混合，再加入176毫克的二硫苏糖醇(99％)并加水将最终体积调至200毫升。放置4小时后将OPA反应试剂弃去。
OPA(蛋白水解程度)由下面的公式计算得来((A×(ODav.，样品-ODav.，对照)/(ODav.，标准-ODav.，对照)×(V1(ml)×100)/(W1(mg)×P))-B)×100％/(C×D)A＝0.9516＝亮氨酸浓度ODav.，样品，在340纳米下样品吸光值的平均值。
ODav.，标准，亮氨酸标准在340纳米下吸光值的平均值ODav.，对照，去离子水在340纳米下吸光值的平均值。
V1(ml)＝稀释体积，单位为毫升W1(mg)＝样品重量，单位为毫克P＝水解样品中马铃薯蛋白质含量百分数B＝0.4，对于马铃薯蛋白质，此数值不变C＝1.0，对于马铃薯蛋白质，此数值不变D＝9.1对于马铃薯蛋白质，此数值不变B、C、D对应于不同蛋白质的不同数值
因此，OPA值可以很好的反应被分析样品中已水解肽键的百分含量。
例五微生物菌种在例六、例七和例八中被用来制造蛋白酶的Af50-34是从NCIB 10309分离得到，并按照EP 0 506 780 B1中所述方法进行遗传学改造后的菌种。而在例六、例九和例十中被用来制造α淀粉酶的SJ5262则是来源于SJ4671，得自US 6,100,063。首先，挑选抗利福平的自发突变菌种，其中RpoB蛋白的第478的氨基酸由缬氨酸取代了原来的丙氨酸，这一菌种即SJ4671rif10，且在丹麦申请了专利，PA 2001 01972。然后，通过WO 02/00907中所述的双同源重组的方法，将编码一个细胞外蛋白酶的基因(其蛋白质序列和基因序列在GeneSeqP的编号为AAE00011；WO 01/16285；EP482 879)缺失。
例六增殖程序Af50-34菌株B3-琼脂培养基蛋白胨6克胃蛋白酶 4克酵母提取物3克肉类提取物1.5克一水合葡萄糖 1克琼脂 20克加去离子水至一升，然后用氢氧化钠溶液或氯化氢溶液将pH值调至7.35，121摄氏度高温灭菌40分钟待用。
等灭菌完毕，温度降至40-50摄氏度，加入经过滤灭菌的1摩尔每升碳酸氢钠溶液(pH值为9，体积比为10％)和经过121摄氏度40分钟高温灭菌的由去离子水配置的脱脂奶粉(质量体积比为10％)。
M9-缓冲溶液二水合磷酸氢二钠8.8克磷酸二氢钾3克氯化纳4克七水合硫酸镁0.2克加入去离子水至1升121摄氏度高温灭菌20分钟种子摇瓶培养基PRK-1大豆50克二水合磷酸氢二钠20克加去离子水至1升，然后用氢氧化钠溶液或氯化氢溶液将pH值调至9.0，将其按每份100毫升分装到具有两个挡板的500毫升锥形瓶中。
121摄氏度高温灭菌20分钟待用。
将Af50-34菌种在B3琼脂培养基上37摄氏度培养24小时后。
用M9缓冲液充分悬浮菌体并用吸光光度计测量650纳米下吸光值，取y毫升(y值由OD(650nm)×y＝0.1计算得出)细胞悬浮液接种到PRK-1摇瓶中，将培养基放置于HT Infors Unitson旋转式摇床以37摄氏度300转每分钟的速度培养22小时待用。
向每个发酵罐中接种80毫升摇瓶培养液即可进行发酵反应。
SJ 5262菌种LB琼脂培养基蛋白胨(来自酪蛋白)10克酵母提取物5克氯化钠10克琼脂12克添加去离子水到1升，并用氢氧化钠或盐酸溶液将pH值调至7(+/-0.2)。
121摄氏度高温灭菌20分钟M9-缓冲溶液二水合磷酸氢二钠8.8克磷酸二氢钾3克氯化纳4克七水合硫酸镁0.2克加入去离子水至1升121摄氏度高温灭菌20分钟种子摇瓶培养基PRK-50大豆片(soy flakes)44克二水合磷酸氢二钠2克加1升自来水，然后用氢氧化钠溶液或氯化氢溶液将pH值调至8.0，将其按每份100毫升分装到具有两个挡板的500毫升锥形瓶中。
121摄氏度高温灭菌60分钟待用。
将SJ 5262菌种在LB琼脂斜面上37摄氏度培养24小时后。
用M9缓冲液悬浮所得菌体并用吸光光度计测量650纳米下吸光值，取y毫升(y值由OD(650nm)×y＝0.1计算得出)细胞悬浮液接种到PRK-50培养基中，将培养基放置于HT Infors Unitson旋转式摇床以37摄氏度300转每分钟的速度培养20小时待用。
向每个发酵罐中接种80毫升，刚刚培养好的菌体即可进行发酵反应。
例七用Af50-34菌种和OPA＝2.9％的马铃薯蛋白在培养基中的发酵反应发酵反应在有4个挡板容量为2升的发酵罐中进行，必须保证足够的通风率使得整个发酵罐中溶解氧的浓度保持在大约20％以上，但通风率也不能超过2l/l/min。
温度控制在37摄氏度，为了防止泡沫的产生，一开始就要在培养基中加入足够量的防沫油。通过不断的添加15％的磷酸溶液或10％的氨水保持反应物的pH值在8.0和7.7之间。
生长培养基在接种后0.1小时即被添加，并保持下面的速度。
距进料开始的时间(小时) 0 10 200培养基添加速率(克每分钟) 0 0.2 0.2组成(make-up)培养基水解的马铃薯蛋白(OPA＝2.9％)100克磷酸二氢钾5克二水合磷酸氢二钠5克七水合硫酸镁2.5克一水合硫酸锰0.02克七水合硫酸亚铁0.08克五水合硫酸铜0.008克氯化锌0.008克柠檬酸0.39克氯化硫铵0.05克核黄素0.004克烟酸0.03克泛酸酯钙0.04克盐酸吡哆醛0.008克生物素0.0015克叶酸0.004克用磷酸溶液或氨水调节pH值到8.0后，加自来水至1升向每个发酵罐中添加720毫升，121摄氏度高温灭菌1小时。
进料培养基水解的马铃薯蛋白(OPA＝2.9％)135克蔗糖300克加自来水至1升121摄氏度高温灭菌1小时分别在接种后49小时、71小时从发酵罐中取少量反应物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
例八用Af50-34菌种和OPA＝为51％的马铃薯蛋白在生长培养基中的发酵反应。
此发酵反应，除了进料培养基中使用的是水解度为51％的马铃薯蛋白外，其余与例七中完全一致，当基于得自水解物中的马铃薯蛋白干物质(110g水解物/l)，该数量对应实施例7中所用的蛋白水解物的量。
例九用SJ 5262菌种和水解度为19.5％的马铃薯蛋白在发酵培养基中的发酵反应发酵反应在有4个挡板容量为2升的发酵罐中进行，转速和通风必须保证足够的通风率使得整个发酵罐中溶解氧的浓度保持在大约20％饱和度以上，但通风任何时候也不能超过2l/l/min。
温度控制在37摄氏度，为了防止泡沫的产生，一开始就要在培养基中加入足够量的防沫油。通过不断的添加15％的磷酸溶液或10％的氨水保持反应物的pH值在7.5和7.0之间。
生长培养基在接种后0.1小时即被添加，随后速度保持不变。
距起始培养的时间(小时) 05200培养基添加速率(克每分钟) 00.15 0.15组成培养基马铃薯蛋白水解物(OPA＝19.5％)187.5克磷酸二氢钾5克磷酸氢二钾5克二水合磷酸氢二钠2.5克七水合硫酸镁2.5克硫酸铵2.5克一水合硫酸锰0.02克七水合硫酸亚铁0.08克五水合硫酸铜0.008克氯化锌0.008克柠檬酸0.39克加自来水至1升，向每个发酵罐中添力720毫升配制好的发酵培养基，121摄氏度高温灭菌1小时。
进料培养基1水合葡萄糖400克加自来水至1升121摄氏度高温灭菌1小时分别在发酵后95小时、116小时从发酵罐中取少量反应物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
例十用SJ 5262菌种的发酵反应，在组成培养基中使用非水解的马铃薯蛋白此发酵反应，除了在组成培养基中使用的是非水解的马铃薯蛋白外，其余与例九中完全一致。，当基于得自水解物/未水解物中的马铃薯蛋白干物质(15g水解物/l)，该数量对应实施例9中所用的蛋白水解物的量。
例十一通过分析计算得出发酵液中酶的活性蛋白酶滴度的测定(例七和例八)采用的是发酵学中最常用的方法，即测定反应产物中酶的活力，WO 89/06279中29-31页所述的就可以用来测定蛋白酶的活性。
α淀粉酶滴度的测定(例九和例十)也采用的是发酵学中最常用的方法，即测定反应产物中酶的活力，WO 95/26397中9-10页所述的就可以用来测定α淀粉酶的活性。
例十二比较分析例七例八例九例十中酶活性Af50-34菌种/蛋白酶马铃薯蛋白水解产物；进料中OPA＝2.9％(例七)在49、71小时取样相关滴度139、130马铃薯蛋白水解产物；进料中OPA＝51％(例八)在49、71小时相对滴度100、68(所有滴度值都以例八中49小时样品的滴度值作为标准。)SJ 5262/α淀粉酶马铃薯蛋白水解产物；组成中OPA＝19.5％(例九)在95、116小时取样相对滴度111、130马铃薯蛋白非水解产物(例十)在95、116小时取样相对滴度100、117(所有滴度值都以例十中95小时样品的滴度值作为标准)根据上述分析可以得出在用预水解的复合氮源(马铃薯)来发酵生产蛋白酶时，较低的预水解度有利于蛋白酶的形成。在用预水解的复合氮源(马铃薯)来发酵生产α淀粉酶时，充分预水解的复合氮源也很有利于α淀粉酶活性的增加，其主要原因是预水解的复合氮源程度可以更好的被微生物吸收利用。
权利要求
1.一种以工业规模生产酶的方法，包括a)用含有一或多种预水解复合氮源的发酵培养基通过微生物发酵的方式生产所需要的酶，这些复合氮源要与含碳水化合物的其他营养源分开灭菌。向复合氮源中添加酸类物质或水解酶以达到所述预水解的目的；b)从发酵培养液中回收所需酶。
2.权利要求1中所述方法，其中的酶包括淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、氧化还原酶、carbohydrolase，和非破坏性蛋白酶或肽酶。
3.权利要求1中所述方法，其中的酶是能自我破坏性蛋白酶或肽酶。
4.权利要求1中所述方法，其中的微生物可选用细菌或真菌。
5.权利要求4中所述方法，其中的细菌是芽孢杆菌。
6.权利要求1中所述方法，其中的复合氮源是含有少于10％碳水化合物的植物来源蛋白。
7.权利要求1中所述方法，其中的复合氮源选自马铃薯蛋白或豌豆蛋白。
8.权利要求1中所述方法，其中的复合氮源是含有少于10％碳水化合物的动物来源蛋白。
9.权利要求1中所述方法，其中的复合氮源选自血液蛋白，鱼肌肉蛋白和动物肌肉蛋白。
10.权利要求2中所述方法，其中的复合氮源预水解破坏10％-70％的肽键。
11.权利要求3中所述方法，其中的复合氮源预水解破坏1-20％的肽键。
12.权利要求1中所述方法，其中的预水解复合氮源的含量按重量计算达到加入培养基的全部凯氏氮总量的至少5％。
13.权利要求1中所述方法，其中的发酵培养基的量至少是50升。
14.权利要求1中所述方法，其中的发酵是重复分批式发酵、流加式发酵、重复流加式发酵或连续式发酵反应。
全文摘要
本发明涉及一种以工业规模生产目的酶的方法，包括a)用含有一或多种部分预水解复合氮源的发酵培养基通过微生物发酵的方式生产所需要的酶，这些部分预水解复合氮源与其他含有碳水化合物的其他营养源分开灭菌，所述预水解通过加入酸和/或水解酶完成；和b)从发酵培养液回收酶。
文档编号C12N9/00GK1665924SQ03815585
公开日2005年9月7日 申请日期2003年6月26日 优先权日2002年7月1日
发明者莫根斯·沃普尔曼, 尼尔斯·班克, 索伦·迈克尔森 申请人:诺维信公司