专利名称：生产佛尔烯醇的方法
技术领域：
本发明涉及从2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮(下文称为酮基异佛尔酮(ketoisophorone))生产(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基-2-环己烯-1-酮(下文称为佛尔烯醇(Phorenol))的方法。更具体的是，本发明涉及通过特定的微生物、其无细胞提取物、重组微生物或重组微生物的无细胞提取物、或左旋二酮还原酶，从酮基异佛尔酮生产佛尔烯醇的方法。
背景技术：
佛尔烯醇是天然产生的光学活性化合物(如玉米黄质)的有用手性构件(building block)。到目前为止已有一些对映体选择性生产佛尔烯醇的方法被报导[Tanaka等人，TetrahedronAsymmetry 61273(1995)；Kiyota等人，TetrahedronAsymmetry 103811(1999)]。但是这些方法对于产物的光学纯度而言是低效的，并且需要多步操作。还没有直接产生光学活性佛尔烯醇的生物方法。
令人惊讶的是，使用能够从左旋二酮产生旋光醇(actinol)的微生物能够通过一步反应从酮基异佛尔酮产生高光学纯度的佛尔烯醇。
发明内容
本发明的一个目的是提供从酮基异佛尔酮产生佛尔烯醇的方法，包括将酮基异佛尔酮与能够从左旋二酮产生旋光醇的微生物或其无细胞提取物接触，并从反应混合物中分离产生的佛尔烯醇。
本发明的另一目的是提供从酮基异佛尔酮产生佛尔烯醇的方法，该方法涉及将酮基异佛尔酮与表达左旋二酮还原酶基因的重组微生物或其无细胞提取物接触，并从反应的混合物中分离产生的佛尔烯醇。
本发明再一目的是提供将酮基异佛尔酮与能够区域和立体选择性地催化酮基异佛尔酮转变成佛尔烯醇的左旋二酮还原酶接触从而从酮基异佛尔酮产生佛尔烯醇的方法。
能够从左旋二酮产生旋光醇的微生物的例子包括纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、动性球菌属(Planococcus)和节杆菌属(Arthrobacter)的野生型成员，以及重组微生物。
优选的微生物选自纤维单胞菌属物种AKU672、水生棒杆菌(Corynebacterium aquaticum)AKU610、水生棒杆菌AKU611、Planococcus okeanokoites AKU152和硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)AKU635，或它们的突变体。这些微生物被公开于EP 0982406。最优选的菌株之一是水生棒杆菌AKU611。
根据布达佩斯条约，以上菌株以F.Hoffmann-La Roche AG(Grenzacherstrasse 124，CH-4070 Basel，瑞士)的名义于1998年8月4日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(AIST)(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)，保藏号为FERM BP-6449(纤维单胞菌属物种AKU672)、FERMBP-6447(水生棒杆菌AKU610)和FERM BP-6448(水生棒杆菌AKU611)。
Planococcus okeanokoites AKU152和硫磺节杆菌AKU635以保藏号IFO 15880(Planococcus okeanokoites AKU152)和IFO 12678(硫磺节杆菌AKU635)被保藏于Institute for Fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka，日本，并可从此处获得。
可以通过如EP 1,122,315描述的方法制备用于本发明的重组微生物，其中公开了包含编码具有左旋二酮还原酶活力的酶的核苷酸序列的遗传物质(如分离的DNA)、这类DNA编码的多肽、重组生物体等等。
所述微生物或重组微生物的正在生长的细胞培养物、静止的细胞培养物、固定的细胞或无细胞提取物等，都可以被用于产生佛尔烯醇。可以通过在含有糖(如葡萄糖或蔗糖)、醇(如乙醇或甘油)、脂肪酸(如油酸和硬脂酸)或它们的酯或油(如菜籽油或大豆油)作为碳源；硫酸胺、硝酸钠、蛋白胨、氨基酸、玉米浆、糠麸、酵母提取物等作为氮源；硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等作为无机盐来源；麦芽汁、肉膏等作为其它营养源的营养培养基中培养所述微生物或重组微生物，从而获得正在生长的细胞培养物。
微生物的培养可以在pH值从4.0到9.0、温度范围从10到50℃的有氧或无氧条件下进行15分钟到72小时，优选的是pH值从5.0到8.0、温度范围从20到40℃、培养时间从30分钟到48小时。在培养过程中适当地混合培养物有利于细胞的生长或反应。
使用由此获得的正在生长的细胞培养物，通过本领域任何通常已知的方法，可以制备静止的细胞培养物或固定的细胞或无细胞提取物。
反应混合物中的酮基异佛尔酮浓度可以根据其它反应条件而变化，但通常为0.1g/l到300g/l，优选1g/l到30g/l。
在本发明中也可以通过将酮基异佛尔酮与左旋二酮还原酶接触来产生佛尔烯醇。
最优选的左旋二酮还原酶之一，以及制备它的方法被描述于EP 1,026,235。这一左旋二酮还原酶的理化性质可以被总结如下1)此左旋二酮还原酶催化左旋二酮的区域和立体选择性还原，形成旋光醇。
2)此酶的相对分子量估计为142,000到155,000±10,000Da，由四个分子量为36,000±5,000Da的同源亚基组成。
3)pH7.0时的最佳温度是15-20℃，最佳pH为7.5。
4)此酶需要NAD+或NADH作为辅因子，并且被单价阳离子(如K+、Na+、Cs+、Rb+和NH4+)高度活化。
左旋二酮还原酶在辅因子存在的情况下按照以下公式催化酮基异佛尔酮还原为佛尔烯醇
例如，按如下完成此标准的酶反应在pH值4.0到9.0、温度10到50℃的条件下孵育基础反应混合物(总体积1ml200μl 1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)、40μl含有8mM NADH的0.2mM的KOH、200μl酮基异佛尔酮溶液和20-80μl酶溶液，用水补到1ml)5分钟到48小时，优选在pH值5.0到8.0、温度20到40℃孵育15分钟到24小时。对于该反应，优选适当地混合反应混合物。
反应混合物中的酮基异佛尔酮浓度可以根据其它反应条件而变化，但通常为0.1g/l到300g/l，优选为1g/l到30g/l。
用有机溶剂(如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或正丁基)提取如上描述的反应混合物中生物学或酶学产生的佛尔烯醇，从而将佛尔烯醇回收进有机溶剂层。通过如气相层析、高效液相层析、薄层层析或纸层析等已知方法分析提取物。在气相层析的情况下，以下条件可以被用作一种实施方案柱子ULBON HR-20M(Shinwa，日本)0.25mmφ×30m柱子温度160℃(恒定)注射器温度250℃载气He(约1ml/min)反应之后，可以回收反应混合物中的佛尔烯醇，例如，通过易于溶解佛尔烯醇的水不混溶有机溶剂(如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或乙酸正丁酯)的抽提来完成。佛尔烯醇进一步的纯化可以通过浓缩提取物从而直接结晶佛尔烯醇或通过组合各种层析(如薄层层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析或高效液相层析)来实现。
以下实施例进一步说明了本发明。
实施例1使用水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)产生佛尔烯醇将水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)接种于含有1.0g/L酵母提取物、15.0g/L Bacto-蛋白胨(Difco laboratories，U.S.A)、0.2g/LMgSO4·7H2O、3.0g/L K2HPO4、2.0g/L NaCl和22.4g/L葡萄糖·H2O的种子培养基(100mL，于500mL烧瓶中)，并于30℃旋转振荡培养24小时。用种子培养物的一部分(100ml)接种含有8.0g/L酵母提取物、0.2g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·4-5H2O、2.0g/L NaCl和11.1g/L葡萄糖·H2O的生产培养基(3.0L，于5-L规模的发酵罐；MJ-5-6型，L.E.Marubishi，日本)。在30℃下以600r.p.m.的搅拌和1.0vvm的通气进行培养。通过使用铵溶液而将pH值保持在7.0。在培养约9小时之后，开始以20g/小时的进料速率补加葡萄糖。自开始发酵起24小时之后，每一条件(温度、搅拌、通气、pH和葡萄糖的进料速率)被分别改变为25℃、200r.p.m.、0.17vvm、6.0和10g/小时，并继续培养24小时。在这一时期，分4次将42g酮基异佛尔酮加入培养基(例如，在这一时期开始时加入20g，第3个小时加入10克，第6小时加入7g，第9小时加入5g)。部分培养液用乙酸乙酯抽提，以便将佛尔烯醇回收于乙酸乙酯层。通过气相层析分析提取物[柱子ULBON HR-20M(Shinwa，日本)0.25mmφ×30m，柱温度160℃(恒定)，注射器温度250℃，载气He(约1ml/min)]。结果产生了8.0g/L的佛尔烯醇(91％的所使用的酮基异佛尔酮被转化)。通过使用手性毛细管柱BGB-176(BGB Analytik AG，瑞士)的气相层析分析，产物的光学纯度为96.0％(e.e.)。
实施例2从水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)基因组DNA中克隆左旋二酮还原酶基因使用Genome Isolation Kit(BIO101)制备水生棒杆菌AKU611(FERMBP-6448)的基因组DNA。以制备的基因组DNA为模板，使用热循环仪(Perkin elmer 2400，U.S.A.)，通过PCR扩增获得没有多余侧翼区域的左旋二酮还原酶基因全长编码序列。使用的两个合成引物如下LV-ORF(+)(5’-GGAGGCGAATTCATGACCGCAACCAGCTCC-3’)(SEQ ID NO1)(划线序列是EcoRI位点的位置)LV-ORF(+)(5’-GGGCTGCTGCAGTCAGTACGCGGCGGA-3’)(SEQID NO2)(划线序列是PstI位点的位置)
PCR混合物(0.02ml)含有5pmol各引物、0.2mM各种dNTP和1U的LA Taq(Takara Shuzo co.LTD/Kyoto，日本)。最初的模板变性步骤为94℃1分钟。扩增循环为98℃20秒、70℃2分钟、72℃4分钟，重复25次。
通过这一反应扩增了含有左旋二酮还原酶基因的全长ORF的DNA片段(0.8Kb)。
用EcoRI和PstI处理扩增的左旋二酮还原酶基因，并与用EcoRI和PstI预消化的载体pKK223-3(Amersham Bioscience/Bucking-hamshire，英格兰)连接，以构建质粒pKKLR(1-15)。用连接混合物转化大肠杆菌JM109，选取若干克隆进行序列分析。检测每一候选克隆中克隆的左旋二酮还原酶基因序列。表现出具有与水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)的左旋二酮还原酶基因序列完全相同的序列的一个克隆被命名为JM109[pKKLR(1-15)]，并被用于进一步的实验。
实施例3使用大肠杆菌JM109[pKKLR(1-15)]生产佛尔烯醇将大肠杆菌JM109[pKKLR(1-15)]接种于含有5.0g/L酵母提取物、10.0g/L Bacto-胰蛋白胨(Difco laboratories，U.S.A)、10.0g/L NaCl、11.1g/L葡萄糖·H2O和50mg/L氨苄青霉素钠(Sigma Chemical Co.，USA)的种子培养基(100mL，于500mL烧瓶中)，并于30℃旋转振荡培养16小时。用种子培养物的一部分(100ml)接种含有7.5g/L K2HPO4、1.9g/L柠檬酸、0.3g/L柠檬酸铁(III)铵、0.49g/L MgSO4·7H2O、22.2g/L葡萄糖·H2O和痕量元素(包括例如(NH4)6(Mo7O24)·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnCl2·4H2O等)的生产培养基(3.0L，于5-L规模的发酵罐；MJ-5-6型，L.E.Marubishi，日本)。在30℃下以600r.p.m.的搅拌和1.0vvm的通气进行培养。通过使用铵溶液将pH值保持在不低于6.0。在培养约9小时之后，开始以3.5g/小时的进料速率补加葡萄糖。自开始发酵起24小时之后，每一条件(温度、搅拌、通气、和葡萄糖的进料速率)被分别改变为25℃、200r.p.m.、0.17vvm和2.0g/小时，并继续培养24小时。在这一时期，分5次将25g酮基异佛尔酮加入培养基(例如，以一定的时间间隔每次加入5g)。部分培养液用乙酸乙酯抽提，以便将佛尔烯醇回收于乙酸乙酯层。通过描述于实施例1的气相层析分析提取物。结果产生了5.6g/L的佛尔烯醇(71％的所使用的酮基异佛尔酮被转化)。通过使用描述于实施例1的手性毛细管柱的气相层析分析，产物的光学纯度为85.7％(e.e.)。
序列表<110>DSM IP资产有限公司<120>生产佛尔烯醇的方法<130>NRRC-AM 15<140>PCT/EP03/4893<141>2003-05-09<160>2<170>PatentIn version3.2<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1<400>1ggaggcgaat tcatgaccgc aaccagctcc 30<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物2<400>2gggctgctgc agtcagtacg cggcgga 2权利要求
1.从2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮(酮基异佛尔酮)生产(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基-2-环己烯-1-酮(佛尔烯醇)的方法，包括将酮基异佛尔酮与能够从左旋二酮产生旋光醇的微生物或其无细胞提取物接触，或与能够从左旋二酮产生旋光醇的重组微生物或其无细胞提取物接触，或与左旋二酮还原酶接触，并从反应混合物中分离产生的佛尔烯醇。
2.从酮基异佛尔酮生产佛尔烯醇的方法，包括将酮基异佛尔酮与能够从左旋二酮产生旋光醇的微生物或其无细胞提取物接触，并从反应混合物中分离产生的佛尔烯醇。
3.从酮基异佛尔酮生产佛尔烯醇的方法，包括将酮基异佛尔酮与选自纤维单胞菌属、棒杆菌属、动性球菌属和节杆菌属成员的、能够将左旋二酮选择性不对称还原为旋光醇的微生物或其无细胞提取物接触，并从反应的混合物中分离产生的佛尔烯醇。
4.根据权利要求3的方法，其中所述微生物选自纤维单胞菌属物种AKU672(FERM BP-6449)、水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)、水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)、Planococcus okeanokoites AKU152(IFO 15880)和硫磺节杆菌AKU635(IFO 12678)，以及它们的突变体。
5.根据权利要求3的方法，其中所述微生物是水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448).
6.从酮基异佛尔酮生产佛尔烯醇的方法，此方法通过将酮基异佛尔酮与表达左旋二酮还原酶基因的重组微生物或其无细胞提取物接触，并从反应混合物中分离产生的佛尔烯醇而实施。
7.根据权利要求6的方法，其中所述左旋二酮还原酶基因来自属于棒杆菌属的微生物。
8.根据权利要求7的方法，其中左旋二酮还原酶基因来自水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其功能等价物、传代培养物、突变体或变异体。
9.从酮基异佛尔酮生产佛尔烯醇的方法，此方法通过将酮基异佛尔酮与能够催化酮基异佛尔酮区域和立体选择性地转变成佛尔烯醇的左旋二酮还原酶接触而实施。
10.根据权利要求9的方法，其中左旋二酮还原酶来自属于棒杆菌属的微生物。
11.根据权利要求10的方法，其中左旋二酮还原酶来自水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其突变体。
12.根据权利要求1-11的方法，其中反应在pH4.0到9.0、温度10到50℃的条件下进行15分钟到72小时。
13.根据权利要求12的方法，其中反应在pH5.0到8.0、温度20到40℃的条件下进行30分钟到48小时。
全文摘要
本发明涉及从2，6，6－三甲基－2－环己烯－1，4－二酮(酮基异佛尔酮)生产(4S)－4－羟基－2，6，6－三甲基－2－环己烯－1－酮(佛尔烯醇)的方法，包括将酮基异佛尔酮与能够从左旋二酮产生旋光醇的微生物或其无细胞提取物接触，或与能够从左旋二酮产生旋光醇的重组微生物或其无细胞提取物接触，或与左旋二酮还原酶接触，并从反应混合物中分离产生的佛尔烯醇。
文档编号C12P7/38GK1665935SQ03815593
公开日2005年9月7日 申请日期2003年5月9日 优先权日2002年7月4日
发明者星野达雄, 田畑和之, 濑户口丰, 清水昌 申请人:Dsmip资产有限公司