含有尿素类氮源的发酵培养基及其用于生产次级代谢产物、酶和重组蛋白的用途
【专利摘要】本发明涉及含有尿素类氮源的发酵培养基及其用于生产次级代谢产物、酶和重组蛋白的用途。本发明涉及一种通过利用微生物发酵以改善磷酸盐摄取来生产重组蛋白、其衍生物或它们的类似物或者次级代谢产物的发酵培养基，培养基特征在于尿素的残留浓度维持在约0.5g/L至约3g/L的范围内，基础盐和微量元素的浓度在对照培养基的0.1X至5X变化，并且其中甲醇补给率为约6g/L/h至约20g/L/h范围。
【专利说明】含有尿素类氮源的发酵培养基及其用于生产次级代谢产物、酶和重组蛋白的用途
[0001]本发明是申请日2009年2月5日、标题为“含有尿素类氮源的发酵培养基及其用于生产次级代谢产物、酶和重组蛋白的用途”申请号200980112059.7的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明描述了碳酸酰胺如尿素或其衍生物、氨基甲酸酯(盐)类、碳二亚胺和硫脲作为发酵培养基中的含氮补充物的用途，该发酵培养基使用甲醇诱导型真菌表达体系如毕赤酵母(Pichia)来生产重组蛋白以实现提高的生物转化率和肽(如胰岛素和胰岛素类似物)、醋酸艾塞那肽(exendin)和酶(如脂酶)。具体而言，本发明的重要方面涉及一种具有优化营养培养基参数的简易发酵方法，该方法能够导致在较短的生产周期中得到高产率。本发明的原则也可适用于通过适合表达有机体的发酵来生产各种蛋白和次级代谢产物。
【背景技术】
[0003]酵母基表达体系如巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)普遍用于表达重组蛋白 Cregg, J.M.et al., in Dev.1nd.Microbiol.29:33 - 41; 19880 巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达体系使用甲醇诱导型醇氧化酶(AOXl)启动子，其控制编码醇氧化酶表达的基因，该酶催化甲醇代谢的第一步Cregg J M.et al.1n Bio/Technologyl1:905 - 910; 1993。巴斯德毕赤酵母能够具有高表达水平、有效分泌胞外蛋白、翻译后修饰如糖基化、并且在生物反应器培养下在基本培养基中生长达到高细胞密度。
[0004]Invitrogen C0. (加利福尼亚，圣地亚哥)的“毕赤酵母发酵方法指南(Pichiafermentation Process Guidelines)”中描述了使用毕赤酵母进行补料分批发酵(fedbatch fermentation)的方法,下文中将其作为对照。为了生产重组蛋白，使使转化的巴斯德毕赤酵母在作为碳源的甘油上生长到期望的高细胞密度生物量。通过向培养物中加入甲醇来引发生产阶段，其中甲醇是诱导剂和唯一的碳源。在生物量生成和产生阶段，氨作为氮源用于控制pH。
[0005]尽管酵母表达体系具有各种优势，但仍然需要优化营养上影响的物理化学环境，从而实现在生物反应器中高效和大量的重组蛋白生产。实现高特异性的生产率是高度期望的。其可以通过优化最初的培养基成分、甲醇加入策略以及工艺的理化参数而实现。已有报道称其中硫酸铵、氨基磷酸、磷酸二铵、硝酸钾、尿素、玉米浆、豆柏、棉籽柏、甘蔗和甜菜糖浆、蛋白胨，谷物的分解物等已被用作细菌、酵母和真菌生长的氮源。在微生物“生长”中使用不同碳源和氮源是现有技术。
[0006]但是，在现有技术的文献中还未曾披露用于高效生产重组蛋白、肽和酶的具体限定的碳源和氮源的最优组合。例如，W0/2007/005646披露了通过在复合生长培养基上培养重组酵母来生产乙醇，其中复合生长培养基包含复合糖类以及各种较廉价的氮源如玉米浆、玉米提取物、酵母自溶物以及尿素。而且，这种方法不采用甲醇诱导型生长或生产机制，这与本发明所开发的生产重组蛋白的方法不同。同样，美国专利第4，288，554号描述了一种仅用于非GMO假丝酵母(non GMO Candida)种生长的连续发酵方法，该方法使用尿素与其他氮源和基本盐培养基相结合。现有技术中并没有任何暗示或教导在可使用甲醇诱导GMO巴斯德毕赤酵母来高效生产重组蛋白以及肽(如人胰岛素和其类似物)或酶(如脂酶)的发酵方法(分批、分批补料(fed batch)、连续)过程中在何处可使用尿素。[0007]人们出人意料的发现，所定义的发酵培养基的使用的特征在于受控加入特定的丰富和易溶氮源(如尿素)，进一步优化尿素以及来自尿素水解产生的氨的残余浓度，从而可以获得更好的产物、更高的生产率以及使生产时间更短。
[0008]多年以前人们就知道可以利用大肠杆菌来生产重组蛋白，并且其表达系统也已经被清楚地研究和理解。基于大肠杆菌的表达系统被广泛用于分子如GCSF、HGH、链激酶和很多其他相似生物制品的生产。对于重组蛋白的生产，以葡萄糖作为碳源使转化的大肠杆菌生长至期望的高细胞密度生物量。通过使用所需的诱导剂诱导而引发生产阶段，然后仅以最低的营养补料维持培养物直到发酵结束。
[0009]多年以前人们就已经使用真菌培养物来生产有价值的生物物质(bio-entities),如酶和其他商品化的分子。真菌培养物如根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)等已被用于传统发酵来生产各种酶如脂酶、淀粉酶、葡聚糖酶等，这些酶用于食品、纺织、皮革以及其他此类工业中。已知放线菌为用于抗生素生产的工作菌种(主力，work-horses)已被广泛用于一些对人类有益的次级代谢产物的生产。真菌和放线菌的关键特性之一是其“生物转化”的特性，如羟基化、酯化等。其主要优点是生物转化是靶特异性的并且可以得到具有相对高纯度的产物。经典的实例是康帕丁转化成普伐他汀。
[0010]本领域已知的方法改进包括发酵技术有关的措施，例如搅拌或供氧，或有关营养培养基成分的改良例如改变发酵过程中的糖浓度、下游工艺变化、或与微生物本身的固有特征有关的变化等。
[0011]人们出人意料地发现，使用特征为受控加入特定丰富且易溶氮源(如尿素)的发酵培养基能够获得更高的生产率和/或更高的生物转化率以及使生产时间更短。
[0012]发明目的
[0013]本发明的主要目的是通过使用甲醇诱导型真菌进行发酵以获得用于生产重组蛋白及其衍生物或其类似物的发酵培养基。
[0014]本发明的另一主要目的是通过使用微生物进行发酵以获得用于生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的发酵培养基。
[0015]本发明的又一主要目的是通过使用微生物进行发酵以获得用于生产次级代谢产物的发酵培养基。
[0016]本发明的另一主要目的是获得用于生产重组或非重组蛋白产物、其衍生物或其类似物的方法。
[0017]本发明的又一主要目的是获得用于生产次级代谢产物的方法。
[0018]本发明的另一主要目的是获得由康帕丁转化为普伐他汀的生物转化方法。
[0019]本发明的又一主要目的是获得重组蛋白产物。
【发明内容】
[0020]因此，本发明涉及一种通过使用甲醇诱导型真菌菌种进行发酵从而生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的发酵培养基，所述培养基的特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺；通过使用微生物进行发酵从而生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的发酵培养基，所述培养基的特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺；通过使用微生物进行发酵从而生产次级代谢产物的发酵培养基，所述培养基的特征在于包含有效浓度的碳酸酰胺；用于生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的方法，该方法包括在发酵培养基中繁殖甲醇诱导型胰岛素表达真菌菌种，所述培养基的特征在于包含有效浓度的碳酸酰胺；用于生产重组或非重组蛋白产物、其衍生物或其类似物的方法，该方法包括在发酵培养基中繁殖诱导或非诱导蛋白表达微生物，所述培养基的特征在于包含有效浓度的碳酸酰胺；用于生产次级代谢产物的方法，该方法包括在发酵培养基中繁殖微生物，所述培养基的特征在于包含有效浓度的碳酸酰胺；由康帕丁转化为普伐他汀的生物转化方法，所述转化在培养基中完成，特征在于所述培养基包含有效浓度的碳酸酰胺；根据所附权利要求中任一项所获得的重组蛋白产物。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1:添加/未添加尿素的IN-105前体的生物量曲线的比较。
[0022]图2:添加/未添加尿素的IN-105前体的产物浓度曲线的比较。
[0023]图3:添加/未添加尿素的胰岛素前体的生物量曲线的比较。
[0024]图4:添加/未添加尿素的胰岛素前体的产物浓度曲线的比较。
[0025]图5:添加/未添加尿素的Glagine前体的生物量曲线的比较。
[0026]图6:添加/未添加尿素的Glagine前体的产物浓度曲线的比较。
[0027]图7:添加/未添加尿素的Exendin前体的生物量曲线的比较。
[0028]图8:添加/未添加尿素的Exendin前`体的产物浓度曲线的比较。
[0029]图9:添加/未添加尿素的酯酶的产物浓度曲线的比较。
[0030]图10:在IN-105前体发酵中，各种尿素浓度获得的生物量曲线。
[0031]图11:在IN-105前体发酵中，各种尿素浓度获得的产物浓度变化曲线。
[0032]图12:在胰岛素前体发酵中，各种尿素浓度获得的生物量变化曲线。
[0033]图13:在胰岛素前体发酵中，各种尿素浓度获得的产物浓度曲线。
[0034]图14:对于IN-105生产的残余尿素浓度和最大产物浓度。
[0035]图15:对于胰岛素前体生产的残余尿素浓度和最大产物浓度曲线。
[0036]图16:甲醇给料速率是~20g/L/h的IN-105前体的生物量变化曲线的比较。
[0037]图17:甲醇给料速率是~20g/L/h的IN-105前体的产物浓度曲线的比较。
[0038]图18:除尿素之外的化合物的研究，测试其他类似化合物对毕赤酵母发酵的生产率的影响。
[0039]图19:尿素对肉汤中磷酸盐离子残余浓度的影响，尿素对菌株的磷酸盐代谢的影响。
[0040]图20:关于普伐他汀生产的培养生长曲线。
[0041]图21:随尿素加入普伐他汀的效价。
[0042]图22:随尿素加入康帕丁至普伐他汀的转化率。
[0043]图23:大肠杆菌中G-CSF生产的WCW比较。
[0044]图24:尿素对GCSF单位生产率的影响。[0045]图25:大肠杆菌中链激酶生产的WCW比较。
[0046]图26:尿素对链激酶单位生产率的影响。
[0047]图27:尿素对使用根毛霉属(Rhizomucor sp)生产酯酶的影响。
【具体实施方式】
[0048] 本发明涉及一种通过使用甲醇诱导型真菌菌种发酵来生产重组蛋白及其衍生物或类似物的发酵培养基，所述培养基的特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0049]本发明的另一种实施方式中，碳酸酰胺选自由包括尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组。
[0050]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺是尿素。
[0051 ] 本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺以液体、喷雾、粉末或球粒形式添加。
[0052]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺的残余浓度达到1M。
[0053]本发明的另一实施方式中，基础盐和微量元素的浓度按照对照培养基的0.1X到5X变化，使碳酸酰胺的残余浓度保持在1M。
[0054]本发明的另一实施方式中，磷酸盐的摄取得到了改善。
[0055]本发明的另一实施方式中，表达重组胰岛素产物的甲醇诱导型真菌菌种选自由包括巴斯德毕赤酵母属(Pichia pastoris)、毕赤酵母菌属(Pichia sp.)、酿酒酵母菌属(Saccharomyces sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)或多形汉森酵母(Hansenula poIymorpha)组成的组。
[0056]本发明涉及一种通过使用微生物进行发酵来生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的发酵培养基，所述培养基特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0057]本发明涉及一种通过利用微生物发酵生产次级代谢产物的发酵培养基，所述培养基特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0058]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺选自由包括尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组。
[0059]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺是尿素。
[0060]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺以液体、喷雾、粉末或球粒形式添加。
[0061]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺的残余浓度达到10g/L。
[0062]本发明的另一实施方式中，微生物选自由包括大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、根霉菌属(Rhizopus sp.)、青霉属(Penillium sp.)和根毛霉属(Rhizomucor sp.)组成的组。
[0063]本发明涉及一种用于生产重组蛋白、其衍生物或其类似物的方法，该方法包括在发酵培养基中繁殖甲醇诱导型胰岛素表达真菌菌种，所述培养基特征在于包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0064]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺选自由包括尿素或其衍生物物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组。
[0065]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺是尿素。
[0066]本发明的另一实施方式中，所生产的重组胰岛素产物是IN-105。
[0067]本发明的另一实施方式中，所生产的重组胰岛素产物是尿素前体物、尿素或其类似物或其衍生物。
[0068]本发明的另一实施方式中，重组胰岛素产物是甘精胰岛素(insulin glargine)。
[0069]本发明的另一实施方式中，所生产的重组蛋白是一种环状或非环状肽。
[0070]本发明的另一实施方式中，重组多肽是醋酸艾塞那肽(exendin)。
[0071]本发明的另一实施方式中，所生产的重组蛋白是酶。
[0072]本发明的另一实施方式中，所生产的重组酶产物是脂酶 。
[0073]本发明的另一实施方式中，所生产的重组蛋白选自包括胰岛素前体物、胰岛素或其类似物或其衍生物、甘精胰岛素(glargine)、醋酸艾塞那肽、羧肽酶和脂酶。
[0074]本发明的另一实施方式中，表达重组胰岛素产物的甲醇诱导型真菌菌种选自由包括巴斯德毕赤酵母、毕赤酵母菌属、酿酒酵母菌属、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属或多形汉森酵母组成的组。
[0075]本发明的另一实施方式中，甲醇诱导型真菌菌种是巴斯德毕赤酵母。
[0076]本发明的另一实施方式中，甲醇给料速率达到每小时20g/L肉汤。
[0077]本发明的另一实施方式中，所获得的最大产物效价高于0.lg/L。
[0078]本发明涉及一种用于生产重组或非重组蛋白产物、其衍生物或类似物的方法，包括在发酵培养基中繁殖诱导型或非诱导型蛋白表达微生物，所述培养基的特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0079]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺选自由包括尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组。
[0080]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺是尿素。
[0081]本发明的另一实施方式中，所生产的重组蛋白产物是G-CSF。
[0082]本发明的另一实施方式中，所生产的重组蛋白是链激酶。
[0083]本发明的另一实施方式中，蛋白产物是脂酶。
[0084]本发明涉及一种用于生产次级代谢产物的方法，该方法包括在发酵培养基中繁殖微生物，所述培养基特征在于其包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0085]本发明的另一实施方式中，次级代谢产物是普伐他汀。
[0086]本发明涉及一种康帕丁转化为普伐他汀的生物转化方法，所述转化在培养基中完成，其特征在于所述培养基包含有效浓度的碳酸酰胺。
[0087]本发明的另一实施方式中，碳酸酰胺选自由包括尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组。
[0088]本发明的另一实施方式中，康帕丁转化为普伐他汀的生物转化为至少35%。
[0089]本发明涉及一种如上文所述获得的重组蛋白。
[0090]本发明的另一实施方式中，所获得的重组蛋白产物选自包括胰岛素前体、胰岛素或其类似物或其衍生物、甘精胰岛素、醋酸艾塞那肽、羧肽酶和脂酶组成的组。
[0091]本发明提供了一种用于配制发酵培养基的营养组合物，该组合物包含氮源如碳酸酰胺(如尿素)及前文中提到的相关形式或衍生物，连同一种或多种其他发酵培养基成分，这些成分被特别地优化从而能够在短时间内得到高产量的胰岛素或相关的类似物或衍生物产物。
[0092]出人意料地发现使用补充有在特定浓度下的特定氮化来源如碳酸酰胺(如尿素)以及相关形式或衍生物的特殊发酵培养基不会影响酵母细胞的生长，反而能够提高生产率。
[0093]其他的含氮成分(如尿素)可以以液体、喷雾、粉末或球粒形式添加。
[0094]实际上，本发明的关键在于以下事实:毕赤酵母的胰岛素或胰岛素类似物发酵工艺的生产率受培养基中尿素含量的巨大影响。因此通过向培养基中添加含氮成分(如尿素)可以以缩短的发酵时间并显著提高产物的产量。
[0095]根据本发明最优选的实施方式，将尿素加入发酵培养基会提高关键成分“磷酸盐”的消耗速率，从而提高生产率。已经发现磷酸盐消耗得越快，发酵周期越短，因此生产率越高。因此，最近发现尿素与磷酸代谢使蛋白或肽表达的速率提高而对生长曲线没有影响并且缩短了发酵时间。
[0096]根据本发明另一方面，发酵结束时，在任何pH下添加尿素都能够使产物回收率提闻。
[0097]因而本发明使得能够获得更高产量的蛋白产物、更短的生产周期、更好地利用给料至发酵过程中的营养，并且总体上减少了资金和产物成本。
[0098]一种适合用于工业发酵过程的使用化学成分确定的培养基的微生物菌株，可以是生产感兴趣的有用化合物的 任何野生型菌株，条件是所述野生型菌株具有良好的生长性倉泛。
[0099]用作生产生物(production organism)的优选酵母包括如巴斯德毕赤酵母、毕赤酵母菌属、酿酒酵母菌属、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属、或多形汉森酵母。
[0100]除此之外，适合于使用化学成分确定的培养基来实施工业发酵过程的微生物菌株可以是通过使感兴趣的亲本菌株进行经典诱变处理或重组DNA转化而获得和/或改进的菌株，条件仍然是所获得的突变或转化微生物菌株在化学成分确定的培养基上具有良好的生长性能。因此，所获得的突变或转化菌株是否应在化学成分确定的培养基上相比于亲本菌株具有改善或相似的生长性能，将取决于亲本菌株在化学成分确定的培养基上的生长性倉泛。
[0101]正如本领域技术人员所知晓的，尽管在所有的情况下最终结果是在较少的时间得到较高的效价，但是不同克隆之间的碳酸酰胺补料的最优浓度不同。
[0102]“发酵介质”或“发酵培养基”是指在其中进行发酵的环境，其包括发酵基质以及其他的原料，发酵微生物利用它产生特定的治疗产物。
[0103]“含氮成分”是在发酵培养基中作为可吸收氮的来源的基质、原料或成分。
[0104]根据本发明的一个重要方面，发酵培养基中优选的含氮成分是碳酸酰胺(如尿素)。其应包括含有N-C0-N或相关基团的化合物。本发明也涉及使用尿素衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰基-N-苯基脲、异丙基吡啶脲、N-苯基脲等或它们的组合。
[0105]所使用的“有效量”是指根据本发明当被引入发酵培养基时产生明显(appreciable)数量/产量的蛋白的尿素或其衍生物的量，进一步地是在更短的时间段内产生明显数量/产量的蛋白的尿素或其衍生物且不影响酵母细胞的生长的量。
[0106]“发酵生物”是指适用于期望的发酵工艺的任何微生物。发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。本发明上下文中的发酵生物的实例是巴斯德毕赤酵母、毕赤酵母属、酿酒酵母菌属、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属或多形汉森酵母。[0107]本发明适用于任何使用甲醇诱导型真菌菌种的重组肽的表达，其并不限于重组表达的肽、蛋白、胰岛素、胰岛素前体、胰岛素衍生物或胰岛素类似物。
[0108]在本文中用于描述蛋白或多肽的术语“重组”，意指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。本文中使用的术语“重组体”与细胞有关，意指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA受体(recipient)的细胞，并且包括已被转染的原代细胞的子代。应当理解，单个亲代细胞的子代可以由于偶然突变或故意突变(deliberate mutation)可以在形态或基因组上与原始亲本不完全相同或并非全部的DNA与原始亲本互补。术语“多肽”、“蛋白”、“肽”是指氨基酸聚合体，而不涉及产物的具体长度；因此，多肽的定义包括肽、寡肽和蛋白。虽然这些寡肽的化学或表达后修饰可以作为【具体实施方式】包括在内或排除在外，但是该术语并不是指或者排除多肽的表达后修饰。在一种实施方式中，分子是多肽或其相关类似物或其衍生物。优选地，多肽是环状肽。根据另一优选的实施方式，多肽是非环状肽。在另一实施方式中，多肽选自由醋酸艾塞那肽、依替巴肽、阿托西班、酶如脂酶、羧肽酶等组成的组。
[0109]胰岛素是51个氨基酸的多肽，这些氨基酸分布在两条氨基酸链之间:A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。两条链通过2个二硫桥彼此连接。胰岛素的应用不仅包括天然存在的胰岛素的应用而且也包括胰岛素衍生物及类似物的应用。例如，胰岛素化合物可以是哺乳动物胰岛素化合物(如人类胰岛素)、或胰岛素化合物衍生物或类似物。
[0110]胰岛素衍生物是天然存在的胰岛素即人类或动物胰岛素的衍生物，其通过取代至少一个天然存在的氨基酸残基和/或加入至少一个氨基酸残基和/或有机残基而区别于相应的在其他方面一致的天然存在的胰岛素。应当理解，术语胰岛素定义了一种由B-和A-链组成的多肽。胰岛素衍生物与天然存在的胰岛素有至少60%的同源性。胰岛素衍生物可以甚至更同源，如至少约75%或至少约90%同源于天然存在的胰岛素。通常而言，胰岛素衍生物与人胰岛素相比具有少许修饰作用。
[0111]当通过基因工程生产胰岛素和胰岛素衍生物时，一种包含B、C和A三条链的胰岛素前体“胰岛素原”经常被表达。所述胰岛素原可以在正确折叠和形成二硫桥之后通过酶促或化学移除C链而转换成胰岛素或胰岛素衍生物。胰岛素原衍生物与天然存在的胰岛素原的B-和A-链可以至少60%同源。然而，连接的C-肽可以选择为完全不同于任何已知的天然存在的C-肽。胰岛素原衍生物可以甚至更加同源，例如至少约75%或至少约90%与天然存在的胰岛素原同源。
[0112]根据本发明的某些实施方式，重组胰岛素产物是IN-105。由此产生的治疗产物具体涉及分子IN-105。IN-105是一种胰岛素分子，其在胰岛素B-链的B29位置的ε氨基酸赖氨酸处与结构式CH30-(C4H20)3-CH2-CH2-C00H的两亲低聚物结合。该分子可在Al、B1和B29处单独结合，在A1、B1和B29的各种组合处双重结合，或在A1、B1和B29的各种组合处三重结合。
[0113]根据本发明的另一方面，利用本发明的发酵培养基通过发酵生产的重组蛋白是环状或非环状肽。
[0114]根据本发明的另一方面，利用本发明的发酵培养基通过发酵生产的重组蛋白是酶。
[0115]在本发明一方面中，发酵过程可包括三个阶段:分批(Batch)、分批补料(可选)以及甲醇诱导发酵阶段。[0116]根据本发明最重要的方面，在本发明的上下文中使用的发酵培养基包含以下成分。还包含制备培养基的方法。
[0117]培养基成分:
【权利要求】
1.一种通过利用微生物发酵以改善磷酸盐摄取来生产重组蛋白、其衍生物或它们的类似物或者次级代谢产物的发酵培养基，所述培养基特征在于尿素的残留浓度维持在约0.5g/L至约3g/L的范围内，基础盐和微量元素的浓度在对照培养基的0.1X至5X变化，并且甲醇补给率范围为约6g/L/h至约20g/L/h。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述尿素选自由尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组；所述尿素是以液体、喷雾、粉末或球粒形式加入。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述微生物选自由大肠杆菌、链霉菌属、曲霉菌属、根霉菌属、青霉属和根毛霉属组成的组。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述重组蛋白选自G-CSF、链激酶和脂酶组成的组。
5.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述次级代谢产物是普伐他汀。
6.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述重组蛋白、其衍生物或它们的类似物产生高于0.5g/L的最大产物效价。
7.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述次级代谢产物实现康帕丁向普伐他汀的至少35%的生物转化率。
8.一种用于生产重组蛋白、及其衍生物或它们的类似物或者次级代谢产物的方法，所述方法包括在发酵培养基中通过利用微生物发酵以改善磷酸盐摄取的步骤，所述发酵培养基特征在于尿素的残余浓度范围为约0.5g/L至约3g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述尿素选自由尿素或其衍生物如二甲基脲、二乙基脲、N-乙酰苯基脲、异丙基吡啶脲、苯基脲或它们的组合组成的组；所述尿素是以液体、喷雾、粉末或球粒形式加入。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述微生物选自由大肠杆菌、链霉菌属、曲霉菌属、根霉菌属、青霉属和根毛霉属组成的组。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述培养基特征在于基础盐和微量元素的浓度在对照培养基的0.1X至5X变化，并且甲醇补给率范围为约6g/L/h至约20g/L/h。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所生产的所述重组蛋白产物选自G-CSF、链激酶和脂酶组成的组。
13.根据权利要求8所述的方法，其中，所生产的所述次级代谢产物是普伐他汀。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述重组蛋白、其衍生物或它们的类似物产生高于0.5g/L的最大产物效价。
15.根据权利要求8所述的方法，其中，所述次级代谢产物实现康帕丁向普伐他汀的至少35%的生物转化率。
【文档编号】C12N1/20GK103642843SQ201310522914
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2009年2月5日 优先权日:2008年2月6日
【发明者】桑贾伊·蒂瓦里, 穆克什·巴布阿帕·帕塔勒, 沙鲁巴·加格, 马扬克·库马·加格, 苏勒克哈·约希, 奇特纳利·拉梅高达·那文·库马, 比马尔·库马, 安努杰·格尔, 哈里什·耶尔 申请人:拜康有限公司