一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生态学研究方法领域，尤其涉及一种测定酸度影响植物选择性吸收氮 源的方法。
【背景技术】
[0002] 土壤中包含多种含氮的化合物，如无机氮、氨基酸、多肽及蛋白质，除无机氮外， 氨基酸也可以作为植物生长的重要氮源。Chapin等（1993)首次发现无菌根的维管植物 喜欢吸收氨基酸，北极苔原无菌根植物白羊毛胡子草吸收氨基酸的量至少占总吸收氮量的 60%，且在以氨基酸为唯一氮源培养时吸收的氮及形成的生物量均比以无机氮为氮源时要 多。诸多研究者通过根系短期吸收试验、实验室有机氮源无菌培养试验、野外植物对同位素 标记有机物质（ 13C，15N双标记）的吸收及植物组织的15N自然丰度等方法，表明许多植物可 以吸收利用环境介质中的多种氨基酸、简单蛋白质等有机氮化合物，而无需将有机氮转化 为无机氮才能被植物吸收利用。
[0003] 自然界中诸如土壤类型、温度、湿度、酸度、C02浓度及N水平等生态环境因子能够 影响土壤有机氮的生物有效性.Warren等研究发现高山以及北极地带植物在低温条件下 优先吸收有机氮（如Gly)，在高温条件下优先吸收无机氮。Baligar等也报道酸度通过 光和作用影响豆科作物有机质和生物量的积累，进而影响豆科植物的生长和养分的吸收。 Xu等发现光照强度对Gly和NH4+的吸收无显著影响，但可通过改变玉米根系形态及其与 根际微生物的竞争关系进而影响植物对有机氮的吸收。水稻、番茄等作物上已经证实高浓 度C02会增加分蘖数、根/冠、光和作用、植物生物量以及植物氮吸收量和微生物固氮量，同 时还具有高产优质效果。Godlewski等以15种农田和野生型植物为供试材料，在无菌条 件下研究它们对有机氮的吸收及其环境适应机制，发现所有植物根系都能够分泌蛋白水解 酶，其分泌量与根系形态、根际环境紧密相关。此外，很多研究发现在不同水平外源有机氮 条件下，氨基酸态氮对植物氮素营养贡献与无机氮（铵态氮、硝态氮）相当，甚至大于无机 氮。不同植物物种能够形成自己独特的适应机制，进而加强对根际环境中的氨基酸吸收。
[0004] 酸度是影响植物生长的最重要的环境因子之一，对不同氮源的选择性吸收具有重 要的影响。随着化肥的大量使用，我国的耕地呈现大面积的酸化。酸度随着地区变化而存 在着巨大的差异，从北向南呈现逐渐降低的趋势。研究酸度对植物吸收氮具有重要的生态 学意义。然而，氨基酸在自然状态下会被微生物迅速分解，一定程度上限制了氨基酸营养的 研究。因此，长期的无菌环境是研究氨基酸代谢生理及环境因素影响氮源选择性吸收的重 要基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，通过以下技 术方案实现： (1)无菌苗的培育：选取饱满的植物种子，在常温下浸泡12h，之后依次采用70%酒精浸 泡1分钟、无菌水冲洗3次、10%过氧化氢浸泡5分钟、无菌水冲洗3次、0.lmolL1氯化萊 浸泡5分钟、无菌水冲洗5次的灭菌方法，再将灭菌后的种子放置于已高压灭菌的培养皿中 发芽3-5天，待植物根系生长至约lcm，将一粒种子放置于已灭菌的装满0. 5%琼脂的50ml 离心管中，置于无菌培养台上培养1-3天，植物通过离心管盖子中心的直径为0. 3cm的小孔 长出，采用南大704硅橡胶密封小孔，该硅胶较软，不会限制植物的生长，待硅胶定型后，添 加含 4mmolLiCaClp2mmol1^1(2504，、2mmol1/腿2卩04、1.4mmol1^]\%504.71120、0.1 IJmolL^1〇04 *2H20^0. 4toolL:^804 ? 5H20^ 1toolL^04 ? 7H20^8toolL^3603^ 10MmolLiMnClp5MmolI^NafDTA和 18.3MmolLiFeSf^.T^O的营养液，试验中所用 器具及无氮营养液均采用高温高压灭菌，采用过〇. 22ym滤膜对氮源灭菌。
[0006] (2)长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响：供试氮源为N03、順4+、甘氨酸，三种 氮源（N03、NH/、甘氨酸）等氮量混合，总浓度为3mM，且每次只标记其中一种氮源(标记物 丰度值为50.223七％15勵3、50.17&七％15順 4+、50.16 3七％1%-甘氨酸)，酸度设口11=4.0、 5. 0、6. 0、7. 0、8. 0五个梯度，共15个处理，采用添加lmolLiH2S04或者NaOH调节酸度，每 种酸度处理设置一空白，以检测自然丰度，每三天更换一次营养液，培养25天后，测定植物 地上部及根系的生物量及 15N丰度。
[0007] (3)短期特定酸度对植物吸收氮源的影响 以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘氨酸为氮源，采用1)方法无菌培养植物25天， 该氮源配比下植物根系生长旺盛，以达到检测对样品质量的要求，取长势基本一致的植物 幼苗，采用无菌水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一整夜(约 l〇h)，将植物放置于含3mM98. 10at.% 15N-甘氨酸的溶液中，设pH=4. 2、6. 2、8. 2三个酸度 处理，吸收4h后破坏性采样。
[0008] (4)短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响 以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘氨酸为氮源，采用1)方法无菌培养植物25天， 该氮源配比下植物根系生长旺盛，以达到检测对样品质量的要求，取长势基本一致的植物 幼苗，采用无菌水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一整夜(约 l〇h)，选取6株长势一致的植物幼苗，将其根系预先放置于50ymolL1CCCP(protonphore carbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone)溶液中1小时，使其根系失活，然后以不 用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM98. 10at.% 15N-甘氨酸的溶液中，设 pH=4. 2、6. 2、8. 2三个酸度处理，进行标记氮源的短期吸收方式试验，吸收4h后破坏性采 样。
[0009] (5)样品处理 经过长期吸收和短期吸收的植物样品采收后，将地上部和地下部分开，植物根系先用 超声波清洗，然后用0.5molL1CaCl2清除吸附在根系表面的氮素，最后用无菌水冲洗干 净，并用吸水纸吸干，植物根系和地上部样品用冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样 品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01molL1硫酸滴定，采用 同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值。
[0010] (6)测定氮源 根据植物对某一氮源的吸收是根据植物体内的15N含量来确定的，采用以下公式计 算：
指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量；4是植物根系或者地上部的 15n丰度值；4指的是未添加标记氮源的15n空白丰度值；為是混合氮源中某一标记氮 源的丰度值，在长期酸度对植物吸收氮源的影响中，为50. 16%(甘氨酸）、50. 22% (N03)、 50.17% (NH4+)，在短期吸收中，为98.10%(甘氨酸）指的是植物地上部或根系 的总氮量。
[0011] 本发明根据无菌环境是研究氨基酸营养的重要基础，单一氮源标记的方法是研究 环境因子对植物吸收混合氮源中特定氮素形态的有效方法，有效地将这两种方法结合起 来，实现了准确且深入的研究环境因子尤其是酸度对植物吸收特定氮源的影响。本发明通 过培育无菌苗、测定长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮 源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响、样品处理、结果计算等过程，深入分 析酸度对植物吸收铵态氮、硝态氮、氨基酸的影响，为研究未来环境变化对植物生长尤其是 氮素吸收的影响提供了方法基础。本发明采用完全无菌的培养环境，深入分析氨基酸对植 物的营养贡献，采用同位素标记技术，可以有效准确的区分酸度对植物吸收不同氮源的影 响。
【附图说明】
[0012] 图1是酸度对小白菜地上部和根系鲜重的影响。
[0013] 图2是酸度对小白菜地上部吸收不同氮源的影响。
[0014] 图3是酸度对小白菜吸收不同氮源比例的影响。
[0015] 图4是酸度对小白菜吸收甘氨酸方式的影响。
[0016]图5是酸度对小白菜地上部甘氨酸吸收的影响。
[0017] 图6是酸度对小白菜根系甘氨酸吸收的影响。
[0018] 图7是酸度对小白菜根系甘氨酸速率的影响。
【具体实施方式】
[0019] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0020] 实施例一： (1)无菌苗的培育：选取饱满的植物种子，在常温下浸泡12h，之后依次采用70%酒精浸 泡1分钟、无菌水冲洗3次、10%过氧化氢浸泡5分钟、无菌水冲洗3次、0. lmol L1氯化萊 浸泡5分钟、无菌水冲洗5次的灭菌方法，再将灭菌后的种子放置于已高压灭菌的培养皿中 发芽3-5天，待植物根系生长至约lcm，将一粒种子放置于已灭菌的装满0. 5%琼脂的50ml 离心管中，置于无菌培养台上培养1-3天，植物通过离心管盖子中心的直径为0. 3cm的小孔 长出，采用南大704硅橡胶密封小孔，该硅胶较软，不会限制植物的生长，待硅胶定型后，添 加含4 mmol LiCaClp 2 mmol 1^1(2504，、2 mmol 1/腿2卩04、1.4 mmol 1^]\%504.71120、0.1 IJmol L ^1〇04 *2H20^0. 4 tool L :^804 ? 5H20^ 1 tool L ^04 ? 7H20^8 tool L ^3603^ 10 Mmol LiMnClp 5 Mmol I^NafDTA和18.3 Mmol LiFeSf^.T^O的营养液，试验中所用 器具及无氮营养液均采用高温高压灭菌，采用过〇. 22ym滤膜对氮源灭菌。
[0021](2)长期特定酸度对小白菜选择性吸收氮源的影响：供试氮源为N03、NH/、 甘氨酸，三种氮源（N03、順4+、甘氨酸）等氮量混合，总浓度为3mM，且每次只标记其中 一种氮源（标记物丰度值为50.22 &丨.％15勵3、50.17 3丨.％15順4+、50.16 3丨.％1%-甘 氨酸），酸度为口诉4.0、5.0、6.0、7.0、8.0五个梯度，共15个处理（〇'1卬11=4.0-50.22 at. % 15N03-NH4+-甘氨酸、T2 :pH=4. 0-N03 -50. 17at. % 15NH4+-甘氨酸、T3 : pH=4. 0-N03 -NH/-50. 16at. % 15N-甘氨酸、T4 :pH=5. 0-50. 22at. % 15N03 -NH4+-甘氨酸、T5 : pH=5. 0-N03 -50. 17at. % 15NH4+-甘氨酸、T6 :pH=5. 0-N03 -NH/-50. 16at. % 15N-甘氨酸、T7 : pH=6. 0-50. 22at. % 15N03 -NH4+-甘氨酸、T8 :pH=6. 0-N03 -50. 17at. % 15NH4+-甘氨酸、T9 : pH=6. 0-N03 -NH/-50. 16at. % 15N-甘氨酸、T10 :pH=7. 0-50. 22at. % 15N03 -NH4+-甘氨酸、 Til:pH=7. 0-N03 -50. 17at.