% 15NH4+-甘氨酸、T12 :pH=7. 0-N03 -NH/-50. 16at. % 15N-甘氨 酸、T13 :pH=8. 0-50. 22at. % 15N03 -NH4+-甘氨酸、T14 :pH=8. 0-N03 -50. 17at. % 15NH4+-甘 氨酸、T15 :pH=8. 0-N03-NH4+-50. 16at.% 15N-甘氨酸，未加&丨.％表明氮源为普通、)，采用 添加lmolLiH2S04或者NaOH调节酸度，每种酸度处理设置一空白，以检测自然丰度，每三 天更换一次营养液，培养25天后，测定小白菜地上部及根系的生物量及 15N丰度。
[0022] (3)短期特定酸度对小白菜吸收氮源的影响 以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘氨酸为氮源，采用步骤（1)方法无菌培养小白 菜25天，该氮源配比下小白菜根系生长旺盛，以达到仪器检测对样品质量的要求，取长势 基本一致的小白菜幼苗，采用无菌水将离心管及小白菜根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥 饿"培养一整夜(约l〇h)，将小白菜放置于含3mM 98. 10 at. % 15N-甘氨酸的溶液中，酸度设 pH=4. 2、6. 2、8. 2三个梯度，采用添加lmol L iH2S04或者NaOH调节酸度，之后进行标记氮 源的短期吸收试验，每个处理设6个重复，完全随机排列，培养环境同预备苗的培养环境一 致，吸收4h后破坏性采样。
[0023] (4)短期特定酸度对小白菜吸收氮源方式的影响 以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘氨酸为氮源，采用1)方法无菌培养小白菜25天，该氮源配比下小白菜根系生长旺盛，以达到检测对样品质量的要求，取长势基本一致的 小白菜幼苗，采用无菌水将离心管及小白菜根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一 整夜(约10h)，选取6株长势一致的小白菜幼苗，将其根系预先放置于50 y mol L 1 CCCP 溶液中1小时，使其根系失活，然后以不用CCCP处理的幼苗做对照，将小白菜放置于含 3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，酸度设pH=4. 2、6. 2、8. 2三个梯度，采用添加lmol L iH2S04或者NaOH调节酸度，进行标记氮源的短期吸收方式试验，吸收4h后破坏性采样， CCCP处理根系后，限制了根系的主动运输，其吸收的氮源均为被动吸收而来，而未经CCCP 处理则为主动吸收与被动吸收的总和。
[0024] (5)样品处理 经过长期吸收和短期吸收的小白菜样品采收后，将地上部和地下部分开，小白菜根系 先用超声波清洗，然后用0.5 mol L1 CaCl2清除吸附在根系表面的氮素，最后用无菌水冲 洗干净，并用吸水纸吸干，小白菜根系和地上部样品用冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪 粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01 mol L1硫酸滴 定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值。
[0025] (6)测定氮源 小白菜对某一氮源的吸收是根据小白菜体内的15N含量来确定，采用以下公式计算：
指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量；4是植物根系或者地上部的 15n丰度值；4指的是未添加标记氮源的15n空白丰度值；為是混合氮源中某一标记氮 源的丰度值，在长期酸度对植物吸收氮源的影响中，为50. 16% (甘氨酸）、50. 22% (N03)、 50. 17% (NH4+)，在短期吸收中，为98. 10% (甘氨酸）指的是植物地上部或根系 的总氮量； 采用无菌培养结合同位素标记的方法，可以深入的研究酸度对小白菜吸收不同氮源的 影响，为未来自然环境的变化可能带来的氮素吸收方面的影响提供了理论基础。
[0026] 从图1可以看出，酸度对小白菜生长具有显著的效应，小白菜地上部与根系鲜 重在pH=4. 0-8.0范围内呈现先升高后降低的趋势，在7.0到达最大。而随着酸度的 继续增加，对小白菜生长有明显的抑制作用。营养液pH与地上部鲜重的拟合方程为： y=-0. 17x2+2. 08x-3. 73 (r=0. 7广)，推测最适地上部生长的的pH为6. 23。
[0027] 从图2可以看出，植物对不同氮源的选择性吸收随着酸度的变化而不断变化。从 酸度对不同氮源的吸收来看，甘氨酸的吸收随着酸度的增加而增加，直至pH=7,在pH=7处 显著高于pH=6、8,且甘氨酸的吸收量略高于硝态氮和铵态氮。在pH=6的条件下，铵态氮与 硝态氮的吸收量最高，这与地上部的生物量规律一致。
[0028] 从图3某一氮源占总氮的比例来看，硝态氮的营养贡献率呈现逐渐降低的趋势， 而铵态氮则无明显趋势，这也符合前人研究表明的铵态氮对pH不敏感的结论。
[0029] 图4表明，在低pH环境下，小白菜被动吸收显著增加，而主动吸收略有下降，表明 酸度改变了根系吸收甘氨酸的方式。
[0030] 从图5可以看出，酸度对小白菜地上部甘氨酸态氮含量无显著影响，表明酸度对 小白菜吸收氮源的影响主要作用于根系。
[0031] 从图6可以看出，酸度显著影响了小白菜根系吸收甘氨酸的方式，低pH条件下被 动吸收增加，而主动吸收减少，高pH下主动吸收和被动吸收均减少。
[0032] 从图7可以看出，高pH降低了主动吸收的量，从而降低了甘氨酸的总吸收量，而低 pH下甘氨酸的吸收速率却没有显著降低。
[0033] 综上所述，酸度对甘氨酸吸收及吸收方式具有显著的影响。在pH为6.2的条件 下，甘氨酸总吸收量及主动吸收量高于pH为4. 2和8. 2条件下，而被动吸收量却显著低于 pH为4. 2处理。小白菜根系生长的环境影响了根系主动吸收与被动吸收，深入了解酸度对 小白菜吸收利用氮素规律及自身调控，是未来应对土壤持续酸化的重要理论基础。该发明 公布的一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，结合了无菌培养与同位素标记的优 势，为研究环境因素对植物吸收氮源的影响提供了方法基础。
【主权项】
1. 一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 无菌苗的培育：选取饱满的植物种子，在常温下浸泡12h，之后依次采用70%酒精浸 泡1分钟、无菌水冲洗3次、10%过氧化氢浸泡5分钟、无菌水冲洗3次、0.1mol L 1氯化萊 浸泡5分钟、无菌水冲洗5次的灭菌方法，之后再将灭菌后的种子放置于培养皿中发芽3-5 天，待植物根系生长至约lcm，将一粒种子放置于已灭菌的装满0.5%琼脂的50ml离心管中， 置于无菌培养台上培养1-3天，植物通过离心管盖子中心的直径为0. 3cm的小孔长出，采用 南大704硅橡胶密封小孔，待硅胶定型后，添加营养液； (2) 长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响：供试氮源为NO3、NH4+、甘氨酸，三种，等 氮量混合，总浓度为3mM，且每次只标记其中一种氮源，标记物丰度值为50. 22 at.% 15NO3、 50.17 at·% 15ΝΗ4+、50·16 at·% 15N-甘氨酸，酸度为口!1=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0五个梯度，共 15个处理，采用添加 Imol L 1H2SO4或者NaOH调节酸度，每种酸度处理设置一空白，以检测 自然丰度，每三天更换一次营养液，培养25天后，测定植物地上部及根系的生物量及 15N丰 度； (3) 短期测定酸度对植物吸收氮源的影响：以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘氨 酸为氮源，采用步骤（1)方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗，采用无菌水 将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一整夜，将植物放置于含3mM 98. 10 at. % 15N-甘氨酸的溶液中，用pH=4. 2、6. 2、8. 2三个酸度处理，吸收4h后破坏性采 样； (4) 短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响：以3mM硝酸钠+0. 5mM硫酸铵+0. 5mM甘 氨酸为氮源，采用步骤（1)方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗，采用无菌 水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中"饥饿"培养一整夜，选取6株长势一致 的植物幼苗，将其根系预先放置于50 μ mol L1 CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以 不用CCCP溶液处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中， 用pH=4. 2、6. 2、8. 2三个酸度处理，进行标记氮源的短期吸收方式试验，吸收4h后破坏性采 样； (5) 样品处理：经过步骤（2)的长期吸收和步骤（3)、（4)的短期吸收的植物样品采收 后，将地上部和地下部分开，植物根系先用超声波清洗，然后用0.5 mol L1 0&(：12清除吸附 在根系表面的氮素，最后用无菌水冲洗干净，并用吸水纸吸干，植物根系和地上部样品用冻 干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪 蒸馏，最后用0.01 mol L1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值； (6) 测定氮源： 根据植物对某一氮源的吸收是根据植物体内的15N含量来确定，采用以下公式计算：指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量，4是植物根系或者地上部的15N 丰度值，4指的是未添加标记氮源的15N空白丰度值，為是混合氮源中某一标记氮源的丰度 值，在长期酸度对植物吸收氮源的影响中，为50. 16%甘氨酸、50. 22% NO3、50. 17% NH4+，在短 期吸收中，为98. 10%甘氨酸，^指的是植物地上部或根系的总氮量。2. 根据权利要求1所述的一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征 在于，步骤（1)的营养液组成为：4 mmol L1CaClp 2 mmol L 1K2SO4,、2 mmol L1KH2POzp I. 4 mmol L 1MgSO4 · 7H20、0· I Mmol L 1NaMoO4 · 2Η20、0· 4 Mmol L 1CuSO4 · 5H20、I Mmol L1ZnSO4OH2Od Mmol L1H3BOp 10 Mmol L1MnCl2' 5 Mmol L 1Na2EDTA 和 18.3 Mmol L 1FeSO4 · 7H20。3. 根据权利要求1所述的一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在 于，试验中所用器具及营养液均采用高温高压灭菌，采用过0.22 μ m滤膜对氮源灭菌。
【专利摘要】本发明提供了一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，通过培育无菌苗、测定长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响、样品处理、结果计算等过程，深入分析酸度对植物吸收铵态氮、硝态氮、氨基酸的影响。本发明方法设计合理，采用完全无菌的培养环境，可以深入分析氨基酸对植物的营养贡献，采用同位素标记技术，可以有效准确的区分酸度对植物吸收不同氮源的影响，实现了准确且深入的研究环境因子尤其是酸度对植物吸收特定氮源的影响。本发明方法为研究未来环境变化对植物生长尤其是氮素吸收的影响提供了方法基础。
【IPC分类】A01C1/00, A01G7/00
【公开号】CN105165435
【申请号】
【发明人】马庆旭, 吴良欢
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月15日