通过将干细胞移植到胆管壁来治疗胰腺和肝脏病症的方法
【专利说明】通过将干细胞移植到胆管壁来治疗膜腺和肝脏病症的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请61/780, 644号W及2014年3 月12日提交的美国专利申请14/207, 191号的优先权。 发明领域
[0003] 本发明大体设及基于细胞的疗法领域。更具体地，本发明设及用于治疗膜腺和肝 脏病症的细胞疗法，特别是干细胞/祖细胞疗法。所确定的干细胞群/祖细胞群可为胆管 树干细胞、肝干细胞、膜腺干细胞、定向肝或膜腺祖细胞、或间充质干细胞。它们也可能是胚 胎干细胞巧巧或诱导多能干细胞（iP巧的衍生物。本申请要求2013年3月13日提交的 美国临时申请61/780, 644号的优先权，其全部内容通过引用合并至本文中。
[0004] 发明背景
[0005] 再生医学已进入了一个新的阶段，干细胞群被移植到患者W恢复受损的或患病的 组织，例如肝脏和膜腺。由于肝炎病毒、饮酒、饮食和代谢疾病、W及其他原因，肝病可能导 致器官衰竭，并且在世界范围内构成了主要的医疗负担。类似地，在世界范围内，膜腺疾病 (特别是糖尿病）是导致健康问题和死亡的主要原因。干细胞/祖细胞疗法是解决运些治 疗需要的可能途径，并且世界范围内临床项目正不断增加W进一步开发运些新型的疗法。 虽然许多类型的前体细胞正用于临床项目测试W治疗肝脏和膜腺，但短期内仅有某些可能 用于临床项目。
[0006] 干细胞生物学概述
[0007] 干细胞或其子代、定向祖细胞都能够持续繁殖并分化成为特化细胞。干细胞的决 定性的定义区别是其自我更新的能力，即，通过对称或非对称细胞分裂而无限期地维持具 有相同性质的种群。相反，祖细胞在发育或再生期间在细胞群的扩增中起到短暂的作用。当 祖细胞的自我更新能力不能被严格确定时，研究人员有时使用术语"干细胞/祖细胞"。对 于设及使用干细胞和/或祖细胞的细胞疗法，也使用运个术语。
[0008] 在哺乳动物胚胎发育的第一阶段，干细胞与后期阶段的原生殖细胞一起具有产生 所有体细胞类型的非凡能力，因此称为多能的。胚胎肝细胞巧巧在大量扩展成为确定性细 胞系期间维持多能性。ES细胞的自我更新潜能显得几乎是无限制的，即使自发性突变和染 色体重排最终降低了它们的实用性。通过导入一小组确定的遗传因子来对成熟体细胞进行 重编程，可产生类似的多能干细胞，运些细胞被称为诱导多能干细胞（iPS)。
[0009] 间充质干细胞或MSC可来源于骨髓、脂肪组织、厮带结缔组织、怖arton氏胶和羊 水，容易在常规培养条件下在培养基中生长，可通过血管通路或通过移植法来移植，并且可 谱系限制成任何中胚层结局（例如骨、软骨、腫、肌肉）。它们能够谱系限制成内胚层或外胚 层结局，但效率极低，W至于运个特点对于临床项目来说没有实用性。MSC对于临床项目的 有用性被证明主要是由于它们生成旁分泌信号（基质和可溶性因子）或由于免疫调节机制 导致的，运些发现使得它们在世界范围内应用于临床项目W缓解肝病和膜腺疾病（包括糖 尿病）。
[0010]
[0011] 确定性干细胞，通常称为"成体干细胞"，存在于胎儿组织和出生后组织中，但限于 胚层（外胚层、中胚层、内胚层）确定的特定谱系。确定性干细胞（及其子代、定向祖细胞） 补充因正常更新或损失和疾病而丧失的成熟细胞。某些成熟细胞类型（例如血细胞W及肠 道内衬细胞或皮肤外层内衬细胞）寿命有限，并且必须被快速替换。其他成熟细胞，例如屯、 肌细胞和某些神经细胞，可持续存在数年。干细胞的增殖和分化必须被严格调节W确保在 正常情况下W及当细胞因疾病或损失原因被替换时能够终生维持合适数量的特化细胞W 及自身干细胞小室。
[0012] 本发明提供一种递送任何干细胞群的方法，特别是递送确定性干细胞或其定向 祖细胞的方法，该方法借助直接注射或借助移植策略而将细胞递送祀向至产生肝和膜腺 的干细胞巢储库。关于移植方法和干细胞培养物"补给效应"的描述，参见美国专利申请 12/213, 100号和13/102, 939号，通过引用将运两份申请的公开内容全部合并至本文中。
[0013] 肝脏、胆管树和膜腺是中肠内胚层器官，是W下活动的中屯、：处理糖原和脂质代 谢、外来物质解毒、营养物质加工w实现优化利用、能量需求调节、w及各种因子（从凝固 蛋白到载体蛋白（如AFP、白蛋白、转铁蛋白））合成。机体的完整性严重依赖于肝、胆管树 和膜腺功能，它们中的任何一个的功能失效，特别是肝功能失效，会导致快速死亡。近年来， 明显认识到，运些组织包含W上皮细胞-间充质细胞关系存在的细胞的成熟谱系。每个谱 系树开始于伴有间充质干细胞（如成血管细胞）的上皮干细胞（例如肝干细胞）。
[0014] 运些细胞产生协同成熟的细胞子代。成熟过程产生上皮细胞和间充质细胞，它们 逐步改变其形态、倍性、生长潜力、生物标记物、基因表达和其他表型性状。肝功能和膜腺功 能是整个成熟谱系中所有细胞的表型性状的净总和。在表1中，我们通过总结肝内不同成 熟谱系阶段的实质细胞的表型性状而提供了代表性例子。我们假设了，在膜腺中，从干细胞 或祖细胞到成熟细胞具有可比较的谱系阶段，但运些并未完全确定。
[0015] 膜腺位于腹膜后并且向十二指肠提供消化酶，并提供调节代谢的激素。运个器官 对于机械处理特别敏感，并且具有局部释放其酶导致自溶的倾向。运种趋势限制了可在该 器官上进行的手术类型，包括用于膜腺疾病或病症的细胞疗法。肝对于手动操作没有膜腺 敏感，但是肝脏需要腹部外科手术或腹腔镜手术才能触及，或借助内窥镜检查而经由胆管 树来触及。
[0016] 因此，本发明预期将细胞导入肝脏和膜腺，而不物理性地干扰或损害运些器官的 物理完整性。
[0017] 发明概述
[0018] 在本发明的一个实施方式中，本发明提供一种治疗膜腺或肝功能素乱或病症的方 法，所述方法包括：(a)分别获得干细胞或其子代、定向祖细胞的悬液；和化）在膜腺的情况 下，将所述悬液导入到肝-膜腺总管的壁之内或之上，或在肝脏的情况下，将所述悬液导入 到离肝较近的胆管树的壁之内或之上，其中大部分细胞驻留在壁内，并且其中所述细胞成 熟为功能性膜腺细胞或肝细胞，并且迁移（假设通过"传送带"机制）至膜腺或肝，从而分 别治疗膜腺或肝功能素乱或病症。所述细胞可为胆管树干细胞或其子代、定向祖细胞，或用 于肝和膜腺的间充质干细胞，或用于肝的肝干细胞或定向祖细胞，或用于膜腺的膜腺干细 胞或其定向祖细胞。如果未来能够成功控制ES细胞或iPS细胞的致瘤潜能而使得它们可 能用于临床，那么它们也可能W运种方式被递送，从而治疗肝脏或膜腺病症。
[0019] 所述细胞悬液优选可结合一种或多种生物材料（例如胶原、黏附分子、蛋白聚 糖、透明质酸、糖胺聚糖链、壳聚糖、藻酸盐、W及合成的、可生物降解的和生物相容性聚合 物，或它们的组合）、生长因子（例如R-脊椎蛋白、成纤维细胞生长因子（FGF)、肝细胞生 长因子化GF)、表皮生长因子巧GF)、血管内皮细胞生长因子（VEGF)、膜岛素样生长因子 I(IGF-1)、膜岛素样生长因子II(IGF-2)、抑瘤素-M、白血病抑制因子化IF)、转铁蛋白、膜 岛素、糖皮质激素、生长激素、雌激素、雄激素、甲状腺素、垂体激素W及它们的组合）、其他 细胞、或它们的组合，W形成移植复合物。
[0020] 所述其他细胞可包含上皮干细胞W及它们的间充质伴体（partners)。例如，胆管 树干细胞（或肝干细胞）、成血管细胞、内皮细胞及星状细胞的前体细胞或它们的组合，并 且可来自于对象的未患病或未发生功能素乱的胆管树的一部分，和/或来自于非自身供体 的胆管树。根据该方法，所述移植复合物（细胞+生物材料+激素/生长因子）可借助腹 腔镜手术或内窥镜手术经由注射而导入，或通过移植到胆管的表面上并且围绕胆管具有生 物可降解覆盖物而导入，或通过海绵（sponge)导入。
[0021] 在本发明的另一个实施方式中，本发明提供一种修复具有处于患病或功能素乱状 态的膜腺的对象的肝脏或膜腺的功能的方法，所述方法包括：(a)获得干细胞和/或定向祖 细胞的悬液；和化）在膜腺的情况下，将所述悬液引至肝-膜腺总管的壁，或在肝脏的情况 下，将所述悬液引至离肝脏较近的胆管壁，其中大部分导入的细胞在体内分别W成熟膜腺 细胞或肝细胞的形式驻留在膜腺或肝脏的至少一部分之中或之上。
[0022] 该方法是基于下述理解而实现的：胆管树内的干细胞群是促成肝脏和膜腺的器官 形成的前体细胞。细胞谱系开始于干细胞巢、胆囊周围腺体内，并在器官内发育为成熟细 胞。胆管树中的胆囊周围腺体含有表现出构成成熟谱系证据的表型性状的细胞，从胆管壁 深处的干细胞群（靠近纤维肌层）到靠近胆管内腔且邻近肝脏或膜腺的成熟细胞。运些细 胞已被表征并且其表型性状随着与器官的邻近度的变化而变化。
[0023] 胆管树是干细胞疗法中细胞移植的合乎逻辑的祀标。在胆管树中存在着干细胞/ 祖细胞网络，其沿径向轴和由近至远轴W成熟谱系形式组织，该干细胞/祖细胞网络在整 个生命期间有助于肝脏和膜腺的器官形成。利用胆管树作为移植祀位的优点有很多。移植 程序可W口诊流程（例如内窥镜法）或W小型手术流程（腹腔镜手术）的形式来进行。运 种策略使得干细胞或祖细胞的移植具有最小的（如果有的话）免疫原性，因此可W避免患 者服用免疫抑制药物。该程序设及移植（grafting)策略，其已被证实有利于植入到祀器官 中；不同于现在许多通过血管途径进行细胞移植的研究者们所记载的在肝内约20%的植 入（engraftment)，移植策略导致近100%的植入。运避免了异位细胞分布（它是通过血管 途径进行细胞移植的严重顾虑），而且优化供体细胞的使用（即避免细胞因死亡或异位细 胞分布而丧失）。
[0024] 运些优点对于膜腺治疗是尤其深远的，因为其对手动操作的敏感性已排除了直接 进入该器官的细胞疗法的任何机会。移植到靠近膜腺的胆管树的部分（肝-膜腺总管）的 干细胞克服了运个主要的困难，使得膜腺的干细胞疗法变成现实。
【附图说明】
[00巧]图1是肝、胆管树和膜腺的示意图，显示它们与十二指肠的连接关系。在胆管树各 个部分都发现了壁内和壁外胆囊周围腺体（PBG)、胆管树的干细胞巢。壁内PBG在胆管壁内 大量存在，位置为从胆管内最内部位置、靠近纤维肌层的位置，到最靠近胆管腔的位置。靠 近纤维肌层的PBG内的细胞包含最大量的非常原生的（p