开，例如KubotaH,ReidLM,Proceedingsofthe化tionalAcademyof Sciences扣SA) 2000 ;97:12132-12137,通过引用将其公开内容全部合并至本文中。
[006引除了提供患病或功能素乱的体内器官的"功能"本身所需的细胞之外，移植体优选 还包括额外的细胞成分，运些细胞成分优选模拟包含上皮细胞-间充质细胞关系（所有组 织的细胞基础）的细胞类别。上皮细胞-间充质细胞关系在每个成熟谱系阶段都是不同的。 上皮干细胞伴有间充质干细胞，并且在它们成熟为组织内的所有各种成体细胞类型过程中 它们的成熟是彼此协调的。运两者之间的相互作用受旁分泌信号介导，该旁分泌信号包括 可溶性信号（例如生长因子）和细胞外基质成分。
[0069] 根据本发明的一个实施方式，分离的细胞群与已知的旁分泌信号（下文将讨论） 和"天然的"上皮细胞-间充质细胞伴体（按需要）组合，从而优化移植体。因此，移植体 将包括上皮干细胞（例如肝干细胞）并混合有它们的天然间充质细胞伴体（例如成血管细 胞）。对于短暂扩增细胞巢（transitamplifyingcellniche)移植体，成肝细胞可与肝星 状细胞的和/或内皮细胞的前体细胞为伴。在一些移植体中，可W制成两组上皮细胞-间 充质细胞伙伴的混合物：肝干细胞与成血管细胞W及成肝细胞与肝星状细胞前体和内皮细 胞前体，W优化肝细胞在宿主组织中的建立。接种了细胞的移植体的微环境由旁分泌信号、 基质和可溶性信号构成，它们在移植体使用的相关谱系阶段产生。
[0070] 移植体也可被调整W控制疾病状态。例如，为使得感染早期谱系阶段并与宿主细 胞协同成熟的谱系依赖性病毒（如某些肝炎病毒）的影响最小化，可W制备对某些病毒的 感染非许可的后期谱系阶段（例如肝细胞及其天然伴体一肝窦内皮细胞）的移植体。
[0071] W膜腺细胞疗法作为模型，一个示例性干细胞移植体将包括胆管树干细胞和成血 管细胞。相反，"成熟"肝细胞的移植体将包括肝细胞、成熟内皮细胞和成熟星状细胞。关于 肝脏的上皮细胞-间充质细胞关系的讨论，参见美国专利申请11/753, 326号，通过引用将 其公开内容全部合并至本文中。
[007引移植材料
[0073] 本发明使用的生物材为细胞支承和信号物质提供支架，运些信号物质对于移植和 再生过程的成功提供辅助作用。因为生物体内实体器官的组织进行持续的重构，解离的细 胞倾向于在合适的环境条件下改变它们的天然结构。关于适用于本发明的应用的移植方法 的讨论，参见美国专利申请13/102, 939号，通过引用将其公开内容全部合并至本文中。
[0074] 在所有的组织中，旁分泌信号包括可溶性信号（种种生长因子和激素）和不溶性 信号（细胞外基质巧CM))。可溶性因子和不溶性基质因子之间的协同效应决定了被移植细 胞的生长和分化响应。基质成分是细胞附着、生存、细胞形状（W及细胞骨架的组成）W及 必需的细胞表面受体（使细胞应答特异性细胞外信号）的稳定化的主要决定因素。
[00巧]已知ECM调节细胞形态、生长和细胞基因表达。可通过利用纯化的ECM成分在间 接体内获得与体内相似的组织特异性化学物质。许多运些化学物质可从商业上获得并且有 利于模拟体内的细胞行为。
[0076] 合适的基质成分包括胶原、黏附分子（例如细胞黏附分子、紧密连接蛋白、基底黏 附分子）、弹性蛋白和形成蛋白聚糖（PG)和葡糖氨基葡聚糖（GAG)的碳水化合物。运些类 别的每一个都界定一类分子。例如，至少有25种胶原类型，每个类型由不同的基因编码，并 且具有独特的调节和功能。各种蛋白质类基质成分（例如胶原、附着蛋白）通常可从商业 上获得。组织特异性形式的葡糖氨基葡聚糖（例如组织特异性肝素）可从天然来源纯化和 /或一些可W被合成。当然，没有葡糖氨基葡聚糖时，移植体也是可W成功的，但可能要更长 时间，并且可能不具有葡糖氨基葡聚糖具有的某些特异性。
[0077] 可能提供移植方法的其他生物材料包括无机的天然物质，例如壳聚糖和藻酸盐， W及许多合成的、生物可降解的且生物相容性的聚合物。运些物质通常通过各种方法被"固 化"（例如，制成凝胶），方法包括热胶凝、光交联或化学交联。但是，对于每种方法，都必然 导致细胞损伤（例如由于过度的溫度范围、UV暴露导致）。关于生物材料的讨论，特别是透 明质酸水凝胶的使用，参见美国专利申请12/073, 420号，通过引用将其公开内容全部合并 至本文中。
[007引具体选择哪种基质成分可由体内梯度来引导，例如从干细胞小室到后期谱系阶段 细胞都变化的梯度。移植体生物材料优选模拟移植体所需要的特定谱系阶段的基质化学性 质。所选择的基质成分的混合物的功效可利用纯化的基质成分和可溶性信号在间接体内研 究中被分析，许多运些成分和信号都是商业上可获得的，它们根据良好生产规范（GM巧方 案生产。被选择用于移植体的生物材料优选引起细胞所需的合适生长和分化响应W实现成 功的移植。
[0079] 对于肝脏来说，与肝干细胞有关的基质化学物质存在于大的肝内导管的胆囊周围 腺体中W及转变成为赫令管（小儿和成人肝脏）的胆管板（胎儿和新生儿肝脏）中。肝实 质细胞的后期谱系阶段在狄氏间隙（SpaceofDisse)中，狄氏间隙是位于实质细胞和内皮 细胞或其他形式间充质细胞之间的区域。
[0080] 除了肝内不同区域细胞成熟度的变化之外，还观察到了基质化学物质的变化。胆 管板或赫令管（并且有可能肝内胆囊周围腺体）中的基质化学物质类似于在胎肝中发现的 基质化学物质，它们由III型和V型胶原（无I型胶原）、透明质酸、结合至α6/β4整合蛋 白的各种形式的层粘连蛋白（例如层粘连蛋白5)W及具有最少硫酸盐化作用的各种形式 的硫酸软骨素蛋白聚糖组成。
[0081] 该区域在邻近赫令管且与成肝细胞相关的部位转变为不同的基质化学物质，其由 IV型、V型和VI型胶原、透明质酸、结合至α/β整合蛋白的各种形式的层粘连蛋白、更多 硫酸盐化的CS-PGSW及微弱硫酸盐化的硫酸肝素蛋白聚糖化S-PG)组成。
[0082] 短暂扩增细胞小室转变为更后期的谱系阶段，并且对于每个连续阶段，基质化学 物质变得更加稳定（例如更多的高度稳定的胶原）、较少更新（turnover)、并且含有更多 的高度硫酸盐化的各种形式的GAG和PG。最成熟的细胞具有各种形式的肝素-PG(HP-PG)， 意味着多种蛋白质（例如生长因子和激素、凝固蛋白）可结合至基质并且通过结合至GAG 中离散的和特定的硫酸化方式而稳定地保持在基质中。因此，基质化学物质从其在干细胞 巢中的起点（具有不稳定的基质化学物质，伴随高更新和最少的硫酸盐化（因而靠近细胞 处具有最少的稳定形式的信号结合））转变为稳定的基质化学物质（具有逐渐增加量的硫 酸盐化作用，因此具有更高水平的靠近细胞处的信号结合）。
[0083] 对于膜腺来说，从干细胞到成熟细胞的基质化学物质的转变产生了与腺泡细胞和 膜岛有关的不同的化学成分。在运些不同之处中已知的是，膜岛尤其富含各种形式的硫酸 肝素蛋白聚糖（憐脂酷肌醇聚糖和共结合蛋白聚糖）、巢蛋白W及网状胶原（如IV型、VI 型），然而腺泡细胞富含各种形式的硫酸软骨素蛋白聚糖、纤连蛋白和各种纤维状胶原。而 且，与膜腺干细胞/祖细胞有关的基质化学物质存在于肝=膜腺管的胆囊周围腺体中。与 膜腺实质细胞的后期谱系阶段相关的基质在膜腺管和膜管腺体中。成熟阶段的基质包括与 膜腺腺泡组织和膜腺膜岛细胞接触的基质。
[0084]因此，本发明考虑到了基质分子的化学成分随着成熟阶段、宿主年龄和疾病状态 而变化。W合适材料进行移植会优化移植细胞在组织中的植入、防止细胞散布至异常位置、 使栓塞问题最小化并且增强细胞在组织内尽快整合的能力。而且，移植体内的因子也可被 选择W使免疫原性问题最小化。
[0085] 对于人肝脏或人胆管树组织的情况，可在无血清条件下培养细胞。人肝干细胞或 成肝细胞化化SC或h皿）可独立被移植，或与成血管细胞/内皮细胞一起被移植。细胞可 悬浮于琉基化的和化学改性的HA(CMHA-S或Glycosil,GlycosanBioSystems,SaltLake City，UT)和KM(Kubota氏培养基）中，并装入一组成对注射器中的其中一个注射器中。另 一个注射器可装有在KM中制备的交联剂，例如聚乙二醇二丙締酸醋或PEGDA。运两个注射 器通过一个针头连接，该针头连接进入两个鲁尔锁定接口。因此，水凝胶中的细胞与交联剂 可通过一个针头露出，从而允许在注射后CMHA-S快速交联到凝胶中。
[0086]CMHA-S中的细胞悬液与交联剂可直接注射或移植到祀组织，其利用由组织（例 如网膜组织）或合成材料（例如蜘蛛丝）制成的小袋来实现。作为选择，细胞可被包封在Glycosil中，而不使用PEGDA交联剂，让悬液在空气中放置过夜，导致二硫键交联至软的粘 性的水凝胶。此外，可添加其他琉基改性的大分子单体，例如明胶-DTPH、肝素-DTPH、硫酸 软骨素-DTPH，W产生模拟体内特定细胞巢的基质化学物质的共价网络。在另一种方式中， 在将PEGDA添加到化ycosil之前，可将含有半脫氨酸或琉基残基的多肤结合至PEGDA，使得 特定的多肤信号被加入至水凝胶中。作为选择，在交联之前，任何多肤、生长因子或基质成 分（如同种型的胶原、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白等）可被加入到Glycosil和细胞溶 液中，使得重要的多肤成分在水凝胶中被被动捕获。
[0087] 透明质酸：透明质酸是碳水化合物的6个大的糖胺聚糖（GAG)家族中的其中一个 的成员，都是糖醒酸与氨基糖[1-3]的聚合物。其他家族包括硫酸软骨素（CS，[葡萄糖醒 酸-半乳糖胺]、)、硫酸皮肤素值S，更加高度硫酸盐化的[葡萄糖醒酸-半乳糖胺]、)、硫 酸肝素化S，[葡萄糖醒酸-葡萄糖胺]、)、肝素（HP，更加高度硫酸盐化的[葡萄糖醒酸-葡 萄糖胺]、）和硫酸角质素化S，[半乳糖-N-乙酷葡糖胺]、)。
[008引 HA是由葡萄糖胺和葡糖醒酸通过β1-4、β1-3键连接的二糖单元构成的。在生 物学上，高分子聚糖是由几百个至多达20000个或更多的二糖单元的线性重复单元构成 的。ΗΑ的分子量通常在血清中为100000化，在滑液中高达2000000,在厮带和玻璃体中高达 8000000。由于其具有高负电荷密度，ΗΑ吸引阳离子并且吸水。运种水合作用使得ΗΑ能够 支撑非常大的压缩负荷。ΗΑ存在于所有组织和体液中，在软结缔组织中含量最丰富，其天然 载水能力让其可能具有其