用于流感诊断的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 巧关申请的香叉引用
[0002] 本申请要求2013年4月1日提交的名称为"床旁（P0C)流感抗病毒易感性测 试（PointOfCareInfluenzaAntiviralSusceptibilityTest)"的美国临时申请第 61/807, 185号的权益，其通过引用W其全文并入本文。
技术领域
[0003] 本文提供的一些实施方式设及用于床旁流感测试的方法、组合物、装置和系统。一 些实施方式设及组合分析。在一些实施方式中，鉴别A型流感或B型流感的分析与测定流 感神经氨酸酶对抗病毒药物的敏感性的分析组合。
【背景技术】
[0004] 流感为公共健康的持续和严重威胁。每年，流感相关疾病在美国导致大约200, 000 例住院和36, 000例死亡。从国家影响视角来看，2010年源于流感的总经济成本估计为290 亿美元。流感的抗病毒疗法在W及时方式给予为治疗或给予用于预防时有效。若干研究得 出神经氨酸酶药物减少症状持续时间的结论。特敏福（Tamiflu)和瑞乐沙巧elenza)均在 针对季节性流感的预防中80%有效。当治疗患有流感的患者时，推荐的是患者在症状的48 小时内开始治疗且延迟越小越好。即时诊断和开始抗病毒治疗导致最佳患者结果。
[0005] 基于对M2通道阻断剂的广泛抗性，推测广泛使用神经氨酸酶抑制剂可能最后导 致在季节性或大流行流感病毒中出现其抗性并非不合理。已在临床研究期间鉴别多种抗神 经氨酸酶抑制剂突变体。在Ξ年期间的监测中，分离了八种对奥司他韦的易感性具有> 10 倍降低的病毒变体。当考虑用于季节性流感管理的基于神经氨酸酶抑制剂的药物的质量分 布时，运些发现应引起暂停。在2007-2008冬季期间出现传染性奥司他韦抗性流感病毒和 在服N1和大流行流感化N1中检测到奥司他韦抗性（2009)之后，WHO在2010年于香港召 开关于抗病毒抗性的第一届全球磋商会。此磋商会的关键结果是在临床环境中或作为国家 监测的部分而W正式状态报导对流感的抗病毒抗性的要求。此外，一些抗病毒剂（如奥司 他韦）引起不良事件，使得仅在需要时开处方是重要的。各种抗病毒药物的覆盖范围可W 随着提供商而变化且具有对于患者的不同成本。医师有责任仅在需要时开处方。尽管成本 次于有效性，如果患者可W用较不昂贵的药物对付过去，那么医师有义务使患者了解该选 项。因此，对于可W提供特异性菌株的诊断W避免不良事件、减缓抗药性的演化且为患者和 美国保健系统产生节约的床旁测试存在未满足的需要。
【发明内容】
[0006] 本文提供的方法、试剂盒、系统和组合物的一些实施方式包括检测流感病毒的方 法，其包括：(a)使样品与适于检测A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析缓 冲剂接触，进而获得免疫分析测试样品；化）使免疫分析测试样品的第一部分与包括检测A 型或B型流感的免疫分析的测试物接触，进而检测样品中A型或B型流感的存在或不存在； (C)使免疫分析测试样品的第二部分与包括神经氨酸酶分析缓冲剂的基质接触，进而获得 神经氨酸酶测试样品；W及（d)使神经氨酸酶测试样品接触神经氨酸酶分析物，进而检测 样品中神经氨酸酶的存在。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂与用于神经氨酸酶活性的 分析不相容。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂抑制神经氨酸酶活性。在一些实施方式 中，步骤（C)和（d)在相同容器中进行。
[0007] 本文提供的一些实施方式包括检测流感病毒的方法，其包括：(a)使样品与适于 神经氨酸酶分析的神经氨酸酶分析缓冲剂接触，进而获得神经氨酸酶测试样品；化）使神 经氨酸酶测试样品的第一部分与包括检测A型或B型流感的免疫分析的测试物接触，其中 神经氨酸酶测试样品接触包含免疫分析缓冲剂的基质，进而获得免疫分析测试样品且检测 样品中A型或B型流感的存在或不存在；和（C)使神经氨酸酶测试样品的第二部分与神经 氨酸酶分析物接触，进而检测样品中神经氨酸酶的存在。在一些实施方式中，神经氨酸酶分 析缓冲剂与检测A型或B型流感的免疫分析不相容。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析 缓冲剂抑制抗体与选自A型流感和B型流感的抗原的特异性结合。在一些实施方式中，基 质包括冻干或干燥的免疫分析缓冲剂。在一些实施方式中，步骤（C)在包含多个室的容器 中进行。
[0008] 在检测流感病毒的方法的一些实施方式中，容器包括多个室。在一些实施方式中， 容器包括包含基质的室，和包含用于神经氨酸酶分析的试剂的室。在一些实施方式中，基质 包含交联多糖。在一些实施方式中，基质选自葡聚糖凝胶和琼脂糖。
[0009] 在一些实施方式中，免疫分析测试样品和神经氨酸酶测试样品通过选自重力、毛 细作用和扩散的一种或多种力在容器中移动。
[0010] 在一些实施方式中，容器包括套筒。在一些实施方式中，容器包含适于使用光电倍 增器读取的多孔套筒。在一些实施方式中，光电倍增器选自光电倍增管和微光电倍增管。在 一些实施方式中，光电倍增器为便携式的。在一些实施方式中，光电倍增器在适合于初级护 理医师办公室的便携式读取器中。在一些实施方式中，光电倍增管表面为圆形且具有约6mm 至IJ9mm的直径，或微光电倍增管为矩形且具有约1mm至IJ3mm的尺寸。
[0011] 在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括测定神经氨酸酶对测试化合物的敏感 性。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括：(a)获得抑制值比率，其中比率包括与不存 在测试化合物情况下相比的神经氨酸酶活性水平的存在测试化合物情况下的神经氨酸酶 活性水平；和化）比较抑制值与抑制阔值的比率，进而测定神经氨酸酶活性对测试化合物 的敏感性。在一些实施方式中，抑制阔值通过检测A型或B型病毒确定。在一些实施方式 中，如果检测A型病毒，那么使用第一抑制阔值，且如果检测B型病毒，那么使用第二抑制阔 值。在一些实施方式中，第一阔值比第二阔值低。在一些实施方式中，抑制阔值通过测试化 合物确定。
[0012] 一些实施方式也包括选择用于治疗流感的测试化合物。
[0013] 在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包含包括含信号传导酶的双酶分析。在一些 实施方式中，神经氨酸酶活性产生用于信号传导酶的底物。在一些实施方式中，神经氨酸酶 分析包括N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，神经氨酸 酶活性产生用于信号传导酶的抑制剂。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括N-乙酷基 神经氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，信号传导酶包括巧光素 酶。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂抑制巧光素酶活性。在一些实施方式中，神经氨酸 酶活性水平使用光电倍增管测量。
[0014] 在一些实施方式中，测试化合物为抗病毒药物。在一些实施方式中，测试化合物 为选自W下的抗病毒药物：奥司他韦（Oseltamivir)、扎那米韦狂anamivir)、拉那米韦 (Xanamivir)和帕拉米韦（Peramivir)。
[0015] 在一些实施方式中，免疫分析包括夹屯、分析。
[0016] 在一些实施方式中，样品获自受试者。在一些实施方式中，受试者疑似患有流感。 在一些实施方式中，受试者为人类。
[0017] 本文提供的一些实施方式包括选择用于流感病毒的治疗的方法，其包括：(a)使 样品与适于检测A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析缓冲剂接触，进而获 得免疫分析测试样品；化）使免疫分析测试样品的第一部分与包含检测A型或B型流感的 免疫分析的测试物接触，进而检测样品中A型或B型流感的存在或不存在；（C)使免疫分析 测试样品的第二部分与包含神经氨酸酶分析缓冲剂的基质接触，进而获得神经氨酸酶测试 样品；（d)使神经氨酸酶测试样品与神经氨酸酶分析物接触，进而测定神经氨酸酶测试样 品的神经氨酸酶对测试化合物的敏感性，所述测定包括：（i)获得抑制值比率，其中比率包 括与不存在一种或多种测试化合物情况下的神经氨酸酶活性水平相比的存在一种或多种 测试化合物情况下的神经氨酸酶活性水平，和（ii)比较抑制值与抑制阔值的比率，进而测 定神经氨酸酶活性对测试化合物的敏感性；和（e)从经测定抑制神经氨酸酶活性的一种或 多种测试化合物选择测试化合物。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂与用于神经氨酸酶 活性的分析不相容。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂抑制神经氨酸酶活性。在一些实 施方式中，步骤（C)和（d)在相同容器中进行。
[0018] 本文提供的一些实施方式包括选择用于流感病毒的治疗的方法，其包括：(a)使 样品与适于神经氨酸酶分析的神经氨酸酶分析缓冲剂接触，进而获得神经氨酸酶测试样 品；化）使神经氨酸酶测试样品的第一部分与包含检测A型或B型流感的免疫分析物接触， 其中神经氨酸酶测试样品与包含免疫分析缓冲剂的基质接触，进而获得免疫分析测试样品 和检测样品中A型或B型流感的存在或不存在；和（C)使神经氨酸酶测试样品的第二部分 与神经氨酸酶分析物接触，进而测定神经氨酸酶测试样品的神经氨酸酶对测试化合物的敏 感性，所述测定包括：（i)获得抑制值比率，其中比率包含相比于不存在一种或多种测试化 合物情况下神经氨酸酶活性水平的存在一种或多种测试化合物情况下的神经氨酸酶活性 水平，和（ii)比较抑制值与抑制阔值的比率，进而测定神经氨酸酶活性对测试化合物的敏 感性；和（e)从经测定抑制神经氨酸酶活性的一种或多种测试化合物中选择测试化合物。 在一些实施方式中，基质包含冻干或W其他方式干燥的免疫分析缓冲剂。在一些实施方式 中，步骤（C)在相同容器中进行。在一些实施方式中，步骤（C)在包含多个室的容器中进行。
[0019] 在选择用于流感病毒的治疗的方法的一些实施方式中，抑制阔值通过检测A型或 B型病毒确定。在一些实施方式中，如果检测A型病毒，那么使用第一抑制阔值，且如果检测 B型病毒，那么使用第二抑制阔值。在一些实施方式中，第一阔值比第二阔值低。
[0020] 在一些实施方式中，容器包括适于使用光电倍增管或微光电倍增管读取的多孔条 带或套筒。在一些实施方式中，光电倍增管微光电倍增管为便携式的。在一些实施方式中， 光电倍增管在适合于初级护理医师办公室的便携式读取器中。在一些实施方式中，光电倍 增管表面为圆形且具有约6mm到9mm的直径，或微光电倍增管为矩形且具有约1mm到3mm的尺寸。
[0021] 一些方法也包括选择用于治疗流感的测试化合物。
[0022] 在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括含信号传导酶的双酶分析。在一些实施 方式中，神经氨酸酶活性产生用于信号传导酶的底物。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析 包括N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，神经氨酸酶活 性产生用于信号传导酶的抑制剂。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括N-乙酷基神经 氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，信号传导酶包括巧光素酶。
[0023]在一些实施方式中，神经氨酸酶活性水平使用光电倍增管测量。
[0024]在一些实施方式中，测试化合物为抗病毒药物。在一些实施方式中，测试化合物 是选自W下的抗病毒药物：奥司他韦（Oseltamivir)、扎那米韦狂anamivir)、拉那米韦 (Xanamivir)和帕拉米韦（Peramivir)。
[00巧]在一些实施方式中，免疫分析包含夹屯、分析。
[0026]在一些实施方式中，样品获自受试者。在一些实施方式中，受试者疑似患有流感。 在一些实施方式中，受试者为人类。在一些实施方式中，受试者样品获自受试者，且受试者 被建议服用选定测试化合物W治疗流感。在一些实施方式中，受试者样品获自受试者，且受 试者被提供有选定测试化合物W治疗流感。
[0027]-些实施方式包括检测流感病毒的诊断系统，其包括：用于测定样品中神经氨酸 酶活性的套筒，其中套筒经配置W将包含对于测定不相容的缓冲剂的样品处理为包含对于 测定相容的缓冲剂的样品；用于检测样品中A型或B型流感的测试物，其中测试物经配置W 将包含对于检测不相容的缓冲剂的样品处理为包含对于检测相容的缓冲剂的样品；经配置 W测量来自测试的信号的第一检测器；和经配置W测量来自套筒的信号的第二检测器。
[0028]在一些实施方式中，套筒包括基质室，所述基质室包括含有对于测定相容的缓冲 剂的套筒基质，和包含用于神经氨酸酶活性测定的试剂的试剂室。在一些实施方式中，套筒 基质包含交联多糖。在一些实施方式中，套筒基质选自葡聚糖凝胶和琼脂糖。
[0029]在一些实施方式中，基质室和套筒室流体连通，使得施用到基质室的样品从基质 室流动到试剂室。在一些实施方式中，样品通过选自重力、毛细作用和扩散的一种或多种力 在套筒中流动。
[0030]在一些实施方式中，套筒包含适于使用光电倍增管或微光电倍增管读取的多孔套 筒。
[0031]在一些实施方式中，测试包括免疫分析。在一些实施方式中，免疫分析为夹屯、分 析。在一些实施方式中，测试包括含对于检测相容的缓冲剂的基质。在一些实施方式中，基 质包含硝化纤维素。在一些实施方式中，对于检测相容的缓冲剂经冻干或干燥。
[0032]在一些实施方式中，第一检测器包括光度计。在一些实施方式中，第一检测器包括 反射率读取器。在一些实施方式中，第二检测器包括光电倍增管或微光电倍增管。在一些 实施方式中，装置包括第一和第二检测器。在一些实施方式中，第一和第二检测器相同。
[0033]在一些实施方式中，装置为便携式的。在一些实施方式中，装置为手持式的。
[0034]-些实施方式包括用于检测流感病毒的试剂盒，其包括：用于测定样品中的神经 氨酸酶活性的套筒，其中套筒经配置W将包含对测定不相容的缓冲剂的样品处理为包含对 测定相容的缓冲剂的样品；和用于检测样品中的A型或B型流感的测试物，其中测试物经配 置W将包含对检测不相容的缓冲剂的样品处理为包含对检测相容的缓冲剂的样品。一些实 施方式包括经配置W测量来自测试的信号的第一检测器；和经配置W测量来自套筒的信号 的第二检测器。一些实施方式包括用于神经氨酸酶活性分析的试剂。在一些实施方式中， 神经氨酸酶活性分析试剂选自：巧光素酶，N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物、N-乙 酷基神经氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物，和抗病毒药物。在一些实施方式中，抗病 毒药物选自：奥司他韦、扎那米韦、拉那米韦和帕拉米韦。一些实施方式包括用于免疫分析 的试剂。在一些实施方式中，免疫分析试剂选自：对A型流感抗原特异的抗体，和对B型流 感抗原特异的抗体。
[0035] -些实施方式包括用于双酶流感神经氨酸酶敏感性分析的经遮蔽抑制剂化合物， 其具有式（I)结构：
[0036]
[0037] 其中办、护和33各自独立地为氨或(：15烷基；11为0、1、2或3;1?%-畑2)">"= 0)CF3;m为 0 或 1;X为-S做或-CH(R5) - ;R5 为-S(0),邸3;且Z为 0、1 或 2。
[0038] 在一些实施方式中，式（I)化合物选自：
[0039]
[0040]
【附图说明】
[0041] 图1描绘用于威利特（Veritor)系统（百克顿-迪金森公司度ectonDickinson)) 的免疫分析测试条带和读取器的实施方式。
[0042] 图2描绘组合侧流免疫分析和药物易感性分析的工作流的实施方式。
[0043]图3描绘测定药物易感性分析中的信号比率的实施方式。
[0044] 图4描绘经遮蔽抑制剂的合成的实施方式。
[0045] 图5描绘用于动态流神经氨酸酶分析的套筒的实施方式。
[0046] 图6为使用便携式读取器测量的巧光对照的相对光单位和浓度的图示。
[0047] 图7为神经氨酸酶分析的相对光单位的图示，且表明双酶分析选择用于治疗的最 佳ΝΑ基抗病毒剂的能力。在实例中，瑞乐沙巧elenza)表现优于特敏福（Tamiflu)。
[0048] 图8为各种稀释度的各种A型流感病毒的抑制值的图示，且表明存在可用于辨别 流感A抗药菌株与流感A药物敏感菌株的相异抑制值，其不同于流感B菌株的值，且BD具 有在AST测试跟随提供A/B分型的常规流感ID测试时在P0C环境中作出判断的能力。
[0049] 图9为各种稀释度的各种B型流感病毒的抑制值的图示，且表明存在可用于辨别 流感B抗药菌株与流感B药物敏感菌株的相异抑制值，其不同于流感A菌株的值，且BD具 有在AST测试跟随提供A/B分型的常规流感ID测试时在P0C环境中作出判断的能力。
[0050] 图10为各种稀释度的病毒混合物的抑制值的图示，且表明本文所述技术在抗药 菌株存在于混合培养物中时标记其存在的能力。甚至更显著的为显示标记具有pH敏感性 NA的高度抗药性流感的能力。
[0051] 图11显示用于抗病毒易感性测试的双酶级联的实施方式中的示例性神经氨酸酶 底物NANA-CF3 (经遮蔽抑制剂）和Ξ氣酬（游离抑制剂）的化学结构。
[0052] 图12描绘设及经遮蔽和游离抑制剂的完整双酶级联的实施方式。
[0053] 图13为两种不同双酶分析的图示，且表明可W用双酶检测化学反应实现的敏感 性的范围。
[0054]图14描绘免疫分析侧流测试条带的实施