实施方式中，神经氨酸酶的底物包括N-乙酷基神经氨酸（唾液酸）的衍生物 和巧光素的衍生物的缀合物。在一些实施方式中，N-乙酷基神经氨酸或其衍生物与巧光 素之间的缀合物通过糖巧键经由N-乙酷基神经氨酸糖环上的--0H基团连接在一起。在 一些实施方式中，糖环上的位置为2'位置，因为此为流感神经氨酸酶偏爱的糖巧键。唾液 酸衍生物的实例包括4-烷基或7-烷基或4, 7烷基N-乙酷基神经氨酸（例如美国专利第 6, 303, 764号和美国专利第6, 420, 552号、第6, 680, 054号中描述的那些，所述专利W全文 引用的方式并入本文中）。一个实例为4, 7甲基化N-乙酷基神经氨酸-蛋火虫巧光素缀合 物。此类缀合物的实施方式提供于美国专利第7, 893, 272号中，其W全文引用的方式并入 本文中。在一些实施方式中，用作神经氨酸酶底物的缀合物可W由关于化盐显示的下式表 示：
[0160]
[0161] 在一些实施方式中，R1、R2、R3各自彼此独立地为氨或具有1-5个碳原子的烷基。
[0162] 在一些实施方式中，神经氨酸酶的底物转化为第二酶，如醋酶，如巧光素酶的抑制 剂。在一些实施方式中，神经氨酸酶的底物包括N-乙酷基神经氨酸（唾液酸）的衍生物和 Ξ氣甲基酬（CF3)的衍生物的缀合物。N-乙酷基神经氨酸的衍生物描述于上文中。在一些 实施方式中，神经氨酸酶的底物为：
[0163]
[0164] 在一些实施方式中，Ξ氣甲基酬抑制剂包括：
[0165]
[016引在一些实施方式中，其中神经氨酸酶的底物转化为第二酶，如醋酶的抑制剂，底物 也被称作经遮蔽抑制剂。用于本文中提供的方法中的一些的经遮蔽抑制剂的实例公开于本 文中。
[0167]示例性合成显示于图4中。在一些实施方式中，样品可化含有来自除流感病毒W 外的来源的神经氨酸酶。在一些实施方式中，不期望的神经氨酸酶使用特异性抗体和抑制 剂抑制。不期望的神经氨酸酶活性使用特异性多克隆或单克隆抗体抑制。举例来说，为了 检测流感病毒神经氨酸酶，来自样品，如细菌物种肺巧链球菌和粘性放线菌（Actinonmyces viscosus)的可能污染的有机体的非特异性神经氨酸酶活性使用对来自运些来源的神经氨 酸酶特异的抗体抑制。此方法是可能的，因为来自不同有机体的神经氨酸酶具有相异氨基 酸序列，其准许产生种特异性或亚种特异性神经氨酸酶抗体。举例来说，特异性抗体通常用 于在神经氨酸酶中和分析中区分流感病毒的神经氨酸酶亚型。 阳16引 紀合分析
[0169] 本文提供的一些实施方式包括组合分析，其中样品经分析W(1)鉴别样品中的A 型或B型流感病毒；和（2)流感病毒神经氨酸酶对某些抗病毒药物的敏感性。在一些实施 方式中，鉴别样品中的A型或B型流感病毒的免疫分析在不同于所述分析的缓冲剂中进行 W测量流感病毒神经氨酸酶对某些抗病毒药物的敏感性。
[0170] 在一些实施方式中，获得标本。在一些实施方式中，标本可包括鼻咽洗涂物、抽出 物和拭出物。在一些实施方式中，可W存在不充分量的标本W在不同缓冲剂中制备若干初 始样品。在一些实施方式中，标本放置于第一缓冲剂中W获得用于第一分析的第一测试样 品。在一些实施方式中，第一测试样品包括与第二分析不相容的缓冲剂。举例来说，第一缓 冲剂可W抑制第二分析。在一些此类实施方式中，第一测试样品转化为包括与第二分析相 容的第二缓冲剂的第二测试样品。在一些实施方式中，第一或第二分析包括鉴别样品中的A 型或B型流感病毒的免疫分析。在一些实施方式中，第一或第二分析为测定流感病毒神经 氨酸酶对某一抗病毒药物的敏感性的分析。
[0171] 在一些实施方式中，标本添加到与鉴别A型或B型流感病毒的免疫分析相容的第 一缓冲剂中W制备免疫分析测试样品。免疫分析测试样品的第一部分可W应用到免疫分析 W鉴别A型或B型流感病毒。第二部分可W通过使免疫分析测试样品与用与神经氨酸酶 活性分析相容的第二缓冲剂平衡的交换基质接触转化为神经氨酸酶分析测试样品。基质 的实例包括交联多糖，如葡聚糖凝胶和琼脂糖。在一些实施方式中，神经氨酸酶包括套筒， 其包括含基质的室。葡聚糖凝胶品种可W是G25中等（medium)、G25粗（course)、G25细 (fine)。床高度可W是一厘米到15厘米的任何位置。在一些实施方式中，树脂可在促进流 感神经氨酸酶的释放和后续神经氨酸酶活性测量的缓冲剂中预洗涂和预平衡地提供。此类 试剂与NA-STARTM和NA-化U0RTM试剂盒和ZstatFluTM产品中见到的那些类似。运些缓冲 剂将通常含有低氯化钢含量，如小于lOOmM且通常小于lOmM。在一些实施方式中，氯化钢 含量为从lOOmM和0.ImM、lOOmM和ImM、lOmM和0.ImMW及lOmM和ImM。运些缓冲剂将通 常含有0.ImM到50mM、ImM到20mM或和4mM到lOmM范围内的巧和/或儀离子W产生最佳 的神经氨酸酶活性测量。用于平衡树脂的缓冲剂的抑应在5与8之间W确保后续神经氨 酸酶活性分析可W在含有抑敏感神经氨酸酶的稀有株，如致死性流感H7N9上操作。穿过 树脂套筒的流感标本可W含有少量与用于释放核壳体W用于流感身份免疫分析的洗涂剂 类似的洗涂剂。洗涂剂可W包括NP-40、胆汁盐、布里杰度rij)-35和曲拉通灯riton)。曲 拉通的实例为曲拉通-X-100。胆汁盐的实例为脱氧胆酸钢。运些组织和病毒裂解剂可W 出现于液体储备液中且在其它情况下W固体可用。曲拉通和NP40可W0. 01%到10%V/ V或0. 5%到3%V/V存在于穿过树脂套筒的样品中。固体洗涂剂可W0. 1%到10%W/V， 或0. 5%到2%W/V范围的浓度存在。
[0172]在一些实施方式中，标本添加到与神经氨酸酶活性分析相容的第一缓冲剂中W制 备神经氨酸酶分析测试样品。神经氨酸酶分析测试样品的第一部分可W应用于神经氨酸酶 活性分析。第二部分可W通过使神经氨酸酶分析测试样品与用与鉴别A型或B型流感病毒 的免疫分析相容的第二缓冲剂平衡的交换基质接触而转化为免疫分析测试样品。此类基质 的实例包括交联多糖，如葡聚糖凝胶、琼脂糖和硝化纤维素。在一些实施方式中，免疫分析 包含测试条带，且基质包含硝化纤维素。在一些实施方式中，第二缓冲剂经冻干或W其它方 式干燥到基质中。提取缓冲剂经设计W使得可用于免疫分析检测的核壳体预先置于标本 垫、缀合物垫或两者中。运些垫（膜）的合适的实例包括玻璃纤维密理博（Millipore)G041、 密理博GFDX和纤维素密理博C083、密理博C048、密理博C068、密理博C083、密理博C248,合 适的密理博垫的特定家族为舒尔维克生产线（SureWickPro化ctLine)。其它合适的实例 为通用电气医疗（GEHealthcare)CFl、CF3、CF4棉短绒、惠特曼融合（WhatmanRision)5、 Std14和Std15,且聚醋标本-缀合物垫为其它实例。图14说明免疫分析核壳体提取试 剂预先置于免疫分析侧流测试条带上的实施方式。 阳17引测量神经氨酸酶对测试化合物的敏威忡
[0174]本文提供的一些实施方式包括测量神经氨酸酶对测试化合物的敏感性。测试化合 物包括抗病毒药物，如针对流感的抗病毒药物。在实施方式中，神经氨酸酶的活性在存在和 不存在测试化合物的情况下测量。活性比可W用于确定抑制值，且抑制值可W与选择的抑 制阔值比较W确定神经氨酸酶是否对测试化合物敏感或具抗性。
[0Π5]在一些实施方式中，抑制阔值可W通过确定具有对于特定测试化合物的已知敏感 性或抗性的一组不同病毒的抑制值确定。每一病毒的抑制值可绘图，且抑制阔值确定为处 于对测试化合物敏感的病毒的抑制值与对测试化合物具抗性的病毒的抑制值之间。申请人 已出乎意料地发现A型流感和B型流感的抑制阔值不同。在一些实施方式中，就某些测试化 合物来说，A型病毒具有比B型病毒低的抑制阔值。在一些实施方式中，如果样品中的流感 病毒类型为已知的（例如A型或B型），那么适当抑制阔值水平可W应用于测试的化合物， 其可W显著增加分析的敏感性，使得能够具有分辨仅具有低水平抗药性的流感株与不显示 任何种类的抗药性的那些株的能力。 阳17引神经氨酸酶测试奪箇
[0177]本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于神经氨酸酶分析的测试套筒。 在一些实施方式中，测定对测试化合物，如测试药物和/或抗病毒药物的敏感性的神经氨 酸酶分析可W在包括基质室和试剂室的套筒中进行。在一些实施方式中，套筒可W包括一 个或多个测试室。测试室可W包括一多个测试室，其用于：无测试化合物的标本+分析试 剂；无标本或测试化合物的分析试剂；标本+分析试剂+测试化合物；和无标本的分析试剂 +测试化合物。在一些实施方式中，测试多种测试化合物，且包括用于每一额外测试化合物 (例如第一、第二、第Ξ、第四等测试化合物）的标本+分析试剂+测试化合物和无标本的分 析试剂+测试化合物的额外测试室。用于标本+分析试剂和/或分析试剂的对照测试室可 W用于在套筒上测试所有测试化合物。在一些实施方式中，基质室与一个或多个其它室，如 经选择W含有标本的室流体连通。在一些实施方式中，测试室包括：（1)在有药物的情况下 的测试，其包括标本、反应混合物和测试药物；（2)在无药物的情况下的测试，其包括标本 和反应混合物；（3)用于反应混合物的对照，其包括反应混合物；和（4)用于测试药物的对 照，其包括反应混合物和药物。在一些实施方式中，可W包括其它对照。
[0178]在一些实施方式中，流体样品添加到基质室中。流体样品通过一个或多个选自扩 散、毛细流动和重力的力流动通过基质室到达经选择W含有样品的室。来自室中发生的反 应的信号可W使用光电倍增管测量。示例性套筒显示于图5中。 阳17引檢测流威病毒的方法
[0180] 本文提供的一些实施方式包括检测流感病毒，其包括使样品与适于检测A型流感 病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析缓冲剂接触，进而获得免疫分析测试样品；使 免疫分析测试样品的第一部分与包含检测A型或B型流感的免疫分析的测试条带接触，进 而检测样品中A型或B型流感的存在或不存在；使免疫分析测试样品的第二部分与包含神 经氨酸酶分析缓冲剂的基质接触，进而获得神经氨酸酶测试样品；和使神经氨酸酶测试样 品与神经氨酸酶分析接触，进而检测样品中神经氨酸酶的存在。在一些实施方式中，免疫分 析缓冲剂与用于神经氨酸酶活性的分析不相容。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂抑制 神经氨酸酶活性。
[0181] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括检测流感病毒的方法，其包括：使 样品与适于神经氨酸酶分析的神经氨酸酶分析缓冲剂接触，进而获得神经氨酸酶测试样 品；使神经氨酸酶测试样品的第一部分与包含检测A型或B型流感的免疫分析的测试条带 接触，其中神经氨酸酶测试样品接触包含免疫分析缓冲剂的基质，进而获得免疫分析测试 样品和检测样品中A型或B型流感的存在或不存在；和使神经氨酸酶测试样品的第二部分 与神经氨酸酶分析接触，进而检测样品中神经氨酸酶的存在。在一些实施方式中，神经氨酸 酶分析缓冲剂与检测A型或B型流感的免疫分析不相容。在一些实施方式中，神经氨酸酶分 析缓冲剂抑制抗体与选自A型流感和B型流感的抗原的特异性结合。在一些实施方式中， 基质包括冻干的免疫分析缓冲剂。
[0182] 在一些实施方式中，基质包括神经氨酸酶分析缓冲剂，且用于神经氨酸酶分析的 试剂在相同容器，如套筒中。在一些实施方式中，容器包括多个室，如包含基质的室，和包含 用于神经氨酸酶分析的试剂的室。在一些实施方式中，基质包括交联多糖，如葡聚糖凝胶和 琼脂糖。在一些实施方式中，容器包括适于使用光电倍增管，如便携式光电倍增管读取的多 孔套筒。多孔条带或多孔条带-树脂套筒随后移动跨越将每一孔直接定位于检测器下方的 轨道。跨越轨道的移动通过经编程W暂停且允许每一孔计数的步进马达进行。
[0183] 在一些实施方式中，免疫分析测试样品和神经氨酸酶测试样品通过一个或多个选 自重力、毛细作用和扩散的力在容器中移动。
[0184] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括测定神经氨酸酶对测试化合物的 敏感性，其包括：(a)获得抑制值比率，其中比率包括与不存在测试化合物情况下的神经氨 酸酶活性水平相比的存在测试化合物情况下的神经氨酸酶活性水平；和化）比较抑制值 与抑制阔值的比率，进而测定神经氨酸酶活性对测试化合物的敏感性。抑制阔值W上的抑 制值比率指示神经氨酸酶活性对测试化合物敏感，并且因此流感株对测试化合物具有敏感 性，而阔值W下的比率指示神经氨酸酶活性对测试化合物不敏感，并且因此流感株对测试 化合物具抗性。在一些实施方式中，抑制阔值通过检测A型或B型病毒确定。在一些实施 方式中，抑制阔值通过测试化合物确定。在一些实施方式中，测试化合物可W根据神经氨酸 酶对测试化合物的敏感性选择w治疗流感。在一些实施方式中，遭受测试流感株之苦的患 者可W被建议服用测试化合物，或测试化合物可W提供给患者，其中神经氨酸酶对测试化 合物敏感。
[0185] 在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括含信号传导酶的双酶分析。在一些实施 方式中，神经氨酸酶活性产生用于信号传导酶的底物。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析 包括N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，神经氨酸酶活 性产生用于信号传导酶的抑制剂。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括N-乙酷基神经 氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，信号传导酶包括巧光素酶。在 一些实施方式中，免疫分析缓冲剂抑制巧光素酶活性。在一些实施方式中，神经氨酸酶活性 水平使用光电倍增管测量。
[0186] 在一些实施方式中，测试化合物为抗病毒药物。在一些实施方式中，测试化合物为 选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉那米韦的抗病毒药物。
[0187] 在一些实施方式中，免疫分析包含夹屯、分析。
[018引在一些实施方式中，样品获自受试者，如人类，如疑似患有流感的受试者。
[0189] 在一些实施方式中，本文所述的组合分析具有就感染剂量来说至少2000TCID5。/ ml、lOOOTCIDso/ml、SOOTCIDso/ml、200TCID5〇/ml、lOOTCIDso/ml或由运些值中的任何两个限 定的范围的流感病毒检测极限。在摩尔基础上，所公开的组合测试具有在至少lOOOfM、 500fM、100fM、10fM或由运些值中的任何两个限定的范围下检测神经氨酸酶的能力。 阳190] 洗择治疗的方法
[0191] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括选择用于流感病毒的治疗的方法， 其包括（a)使样品与适于检测A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析缓冲剂 接触，进而获得免疫分析测试样品；化）使免疫分析测试样品的第一部分与包含检测A型或 B型流感的免疫分析的侧流测试条带接触，进而检测样品中A型或B型流感的存在或不存 在；（C)使免疫分析测试样品的第二部分与包含神经氨酸酶分析缓冲剂的基质接触，进而 获得神经氨酸酶测试样品；（d)使神经氨酸酶测试样品与神经氨酸酶分析接触，进而测定 神经氨酸酶测试样品的神经氨酸酶对测试化合物（例如流感抗病毒药物）的敏感性，测定 包括：（i)获得抑制值比率，其中比率包括与不存在测试化合物情况下的神经氨酸酶活性 水平相比存在测试化合物情况下的神经氨酸酶活性水平，和（ii)比较抑制值与抑制阔值 的比率，进而测定神经氨酸酶活性对测试化合物的敏感性；和（e)选择或鉴别测定的抑制 神经氨酸酶活性的测试化合物。在一些实施方式中，抑制阔值通过检测A型或B型病毒确 定。在一些实施方式中，免疫分析缓冲剂与用于神经氨酸酶活性的分析不相容。在一些实 施方式中，免疫分析缓冲剂抑制神经氨酸酶活性。在一些实施方式中，步骤（C)和（d)在相 同容器中进行。在一些实施方式中，受试者疑似患有流感。在一些实施方式中，受试者为人 类。
[0192] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括选择用于流感病毒的治疗的方法， 其包括：(a)使样品与适于神经氨酸酶分析的神经氨酸酶分析缓冲剂接触，进而获得神经 氨酸酶测试样品；化）使神经氨酸酶测试样品的第一部分与包含检测A型或B型流感的免 疫分析的测试条带接触，其中神经氨酸酶测试样品接触包含免疫分析缓冲剂的基质，进而 获得免疫分析测试样品和检测样品中A型或B型流感的存在或不存在；和（C)使神经氨酸 酶测试样品的第二部分与神经氨酸酶分析接触，进而测定神经氨酸酶测试样品的神经氨酸 酶对测试化合物的敏感性，测定包括：（i)获得抑制值比率，其中比率包括与不存在测试化 合物情况下的神经氨酸酶活性水平相比较的存在测试化合物情况下的神经氨酸酶活性水 平，和（ii)比较抑制值与抑制阔值的比率，进而测定神经氨酸酶活性对测试化合物的敏感 性讯（e)选择测定的抑制神经氨酸酶活性的测试化合物。在一些实施方式中，抑制阔值通 过检测A型或B型病毒确定。在一些实施方式中，基质包含冻干的免疫分析缓冲剂。在一 些实施方式中，步骤（C)在相同容器中进行。
[0193] 在一些实施方式中，抑制阔值通过检测A型或B型病毒测定，其中如果检测A型流 感病毒，那么使用第一抑制阔值，如果检测B型流感病毒，那么使用第二抑制阔值。在一些 实施方式中，抑制阔值在检测A型流感病毒的情况下比在检测B型流感病毒的情况下低。
[0194] 在一些实施方式中，容器包括多个室，如包含基质的室，和包含用于神经氨酸酶分 析的试剂的室。在一些实施方式中，