基质包括交联多糖，如葡聚糖凝胶和琼脂糖。
[0195] 在一些实施方式中，容器包括套筒，如适于使用光电倍增管读取的多孔套筒。在一 些实施方式中，光电倍增管为便携式的。
[0196] 在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括含信号传导酶的双酶分析。在一些实施 方式中，神经氨酸酶活性产生用于信号传导酶的底物。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析 包括N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，神经氨酸酶活 性产生用于信号传导酶的抑制剂。在一些实施方式中，神经氨酸酶分析包括N-乙酷基神经 氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物。在一些实施方式中，信号传导酶包含巧光素酶。在 一些实施方式中，神经氨酸酶活性水平使用光电倍增管测量。
[0197] 在一些实施方式中，测试化合物为抗病毒药物。在一些实施方式中，测试化合物为 选自W下的抗病毒药物：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉那米韦。
[019引在一些实施方式中，免疫分析包含夹屯、分析。
[0199]在一些实施方式中，样品获自受试者。 阳200]系统巧试剂念
[0201] 本文中提供的一些实施方式包括用于检测流感病毒的诊断系统。在一些实施方式 中，此类系统包括用于测定样品中的神经氨酸酶活性的套筒，其中套筒经配置W将包含对 测定不相容的缓冲剂的样品处理为包含对测定相容的缓冲剂的样品；和检测样品中的A型 或B型流感的测试条带，其中测试条带，如侧流条带经配置W将包含对检测不相容的缓冲 剂的样品处理为包含对检测相容的缓冲剂的样品。在一些实施方式中，此类系统也包括经 配置W测量来自套筒的信号的第一检测器讯经配置W测量来自测试条带的信号的第二检 测器。
[0202] 在一些实施方式中，套筒包括基质室，所述基质室包括含对于测定相容的缓冲剂 的套筒基质，和包括用于神经氨酸酶活性测定的试剂的试剂室。在一些实施方式中，套筒基 质包括交联多糖。在一些实施方式中，套筒基质选自葡聚糖凝胶和琼脂糖。在一些实施方 式中，基质室和套筒室流体连通，使得施加到基质室的样品从基质室流动到试剂室。在一些 实施方式中，样品通过一个或多个选自重力、毛细作用和扩散的力在套筒中流动。在一些实 施方式中，套筒包括适于使用光电倍增管读取的多孔套筒。
[0203] 在一些实施方式中，测试条带包含免疫分析。在一些实施方式中，免疫分析为夹屯、 分析。在一些实施方式中，测试条带包括含用于检测的相容缓冲剂的基质。在一些实施方 式中，基质包括硝化纤维素。在一些实施方式中，用于检测的相容缓冲剂被冻干。
[0204] 在一些实施方式中，第一检测器包括光度计。在一些实施方式中，第一检测器包括 反射率读取器。在一些实施方式中，第二检测器包括光电倍增管。在一些实施方式中，装置 包括第一和第二检测器。在一些实施方式中，第一和第二检测器相同。在一些实施方式中， 装置为便携式的。在一些实施方式中，装置为手持式的。在一些实施方式中，侧流条带和多 孔条带/树脂套筒在具有两个独立检测模式，但共用公用电源和查阅ID和AST两者的结果 的显示器的公用平台上读取。
[0205] 本文中提供的一些实施方式包括用于检测流感病毒的诊断试剂盒。在一些实施方 式中，此类试剂盒包括用于测定样品中的神经氨酸酶活性的套筒，其中套筒经配置W将包 括对测定不相容的缓冲剂的样品处理为包含对测定相容的缓冲剂的样品；和检测样品中的 A型或B型流感的测试条带，其中测试条带经配置W将包含对检测不相容的缓冲剂的样品 处理为包含对检测相容的缓冲剂的样品。
[0206] -些实施方式也包括经配置W测量来自套筒的信号的第一检测器；和经配置W测 量来自测试条带的信号的第二检测器。
[0207] -些实施方式也包括用于神经氨酸酶活性分析的试剂。在一些实施方式中，神经 氨酸酶活性分析试剂选自：巧光素酶，N-乙酷基神经氨酸和巧光素或其衍生物、N-乙酷基 神经氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的缀合物，和抗病毒药物。在一些实施方式中，抗病毒药 物选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉那米韦。
[020引一些实施方式也包括用于免疫分析的试剂。在一些实施方式中，免疫分析试剂选 自：对A型流感抗原特异的抗体，和对B型流感抗原特异的抗体。
[0209]实施例邮10]连施例1-紀合分析
[0211] 此实例说明A型或B型流感测试和神经氨酸酶抗药性测试情况下的示例性工作 流。试剂盒，包括：含有免疫分析提取缓冲剂和具有开口的盖的施用器管；包括鉴别A型或 B型流感的侧流免疫分析的第一测试装置；和包括测定神经氨酸酶抗药性的动态流分析的 第二测试装置，其从包装打开且每一组件标记有患者标识。使用拭子从患者的鼻子收集标 本。拭子插入到提取缓冲剂中且紧靠内壁旋动Ξ次。拭子在挤压管侧边时从提取缓冲剂去 除，且随后丢弃。施用器管的盖附接到管。
[0212] 施用器管经倒置且Ξ滴（约85μ1)提取缓冲剂挤过盖且施用到第一测试装置。第 一测试装置包括与含有用于第一测试的第一测试缓冲剂的检测器试剂不重叠的标本垫。标 本通过第一测试缓冲剂扩散到第一测试装置的测试位置中。第一测试装置溫育10分钟，且 第一测试的结果使用读取器测量。读取器提供A型或Β型流感病毒是否存在于样品中的指 /J、-〇
[0213] 施用器管倒置且剩余的提取缓冲剂挤过盖且施用到第二测试装置。在此测试中， 神经氨酸酶的增加导致巧光素酶信号的增加。第二装置包括缓冲剂交换室（也称为基质 室）和反应室。标本通过缓冲剂交换室扩散到用于神经氨酸酶抗药性分析的反应室。抑制 值为有测试药物情况下的信号与无测试药物情况下的信号的比率，考虑由反应混合物和测 试药物产生的信号的背景水平。反应室显示于表5A中。
[0214]表 5A[021 引
[021 sT_溫育第二测试装置且使用光电倍增管测量来自每一室的信号。使用下式测定来自 每一反应室的信号的抑制值：
[0217]
[021引根据第一测试中测定的流感类型和使用的测试抗病毒药物选择每一测试抗病毒 药物的药物敏感性阔值水平。如果抑制值低于抑制阔值，那么神经氨酸酶测定为对测试抗 病毒药物具有敏感性。 邮1引 连施例2-化由倍蜡管巧备的灵敏麼
[0220] 此实施例表明滨松（Hamamatsu)TO-Can光电倍增管装置的敏感性灵敏度和在便 携式手持系统中进行低暗噪音阅读的能力。相对光单位（RLU)使用滨松TO-Can光电倍增 管装置对于各种浓度的正化学发光信号产生对照试剂（CellTiterGlo)进行测量。对照 包括背景对照和暗计数对照。结果显示于图6中。 阳2引]连施例3-双酶分析
[022引 此实施例表明测试株A/密西西比（Mississippi)/03/2001A化1N1)肥75Y的双酶 分析，所述株包含对扎那米韦具有敏感性且对奥司他韦具抗性的神经氨酸酶。包含测试株 的标本稀释为1/3000或1/9000且施用到动态流测试装置。动态流测试分析中的测试室包 括表5A中的那些，也就是说：（1)反应混合物+标本；(2)反应混合物+标本+测试抗病毒 药物；（3)对照：反应混合物；和（4)对照：反应混合物+测试抗病毒药物。来自每一测试室 的信号使用光电倍增管装置测量。结果显示于图7中。分析显示相比于奥司他韦，测试株 对扎那米韦更具有敏感性。 阳22引 连施例4-各种流威A株的敏威忡
[0224] 此实施例表明测定对奥司他韦具有已知敏感性或抗性的一组A型流感病毒的抑 制阔值水平。标本由各种稀释度的各种流感A株制备，且施用到具有奥司他韦的动态流测 试装置。关于动态流分析的测试室包括表5A中的那些，也就是说：（1)反应混合物+标本； (2)反应混合物+标本+测试抗病毒药物；(3)对照：反应混合物；和（4)对照：反应混合物 +测试抗病毒药物。来自每一测试室的信号使用光电倍增管测量。如同实施例1测定每一 菌株的抑制值。抑制值标绘于各种稀释度的每一株的图示上，且阔值抑制值从所述图示测 定。辨别药物敏感性与药物抗性的阔值抑制值或截止值为约0.6。截止测定为其中来自药 物敏感株的误差条不与流感抗性株重叠的值。参见图8。 阳2巧]连施例5-各种流威B株的敏威忡
[0226] 此实施例表明测定对奥司他韦具有已知敏感性或抗性的一组A型流感病毒的抑 制阔值水平。如实施例4制备和测试标本。测定每一菌株的抑制值。抑制值标绘于各种稀 释度的每一菌株的图示上，且阔值抑制值从所述图示测定。辨别药物敏感性与药物抗性的 阔值抑制值或截止值为约1. 55。参见图9。 阳227]连施例6-缓冲剂香换对侧流分析的影响
[022引此实施例表明在从动态流神经氨酸酶分析缓冲剂的缓冲剂交换之后，测定标本中A型或B型流感的侧流免疫分析的敏感性。各种稀释度的流感病毒的标本:A/PR/8/34、B/ 佛罗里达（Florida)/4/2006和A/德克萨斯（Texas)/12/2007使用W下测试：（1)根据药 品说明书的侧流威利特?分析，或（2)伴W从动态流分析提取缓冲剂到存在于侧流垫中的 免疫分析提取缓冲剂的缓冲剂交换的侧流威利特?分析。信号经测量且读取器提供每一样 品中A型和/或B型流感的不存在的存在的测定。表6概括结果。值得注意的是，相比于 根据药品说明书的威利特分析，A型或B型流感在使用伴W缓冲剂交换的威利特?的方案 的分析中在更多稀释标本中鉴别。
[0229]表 6
[0230]
阳23引连施例7-免巧分析巧双酶化E)分析的敏威忡
[0233] 奥司他韦的威利特免疫分析和双酶神经氨酸酶动态流动分析在各种稀释液度的 流感病毒：A/佩思（Perth)/211/2001WT上进行。表7概括两个实验的结果。运些结果展 示将免疫分析提取缓冲剂中的标本施用到用神经氨酸酶活性缓冲剂预平衡的G25M葡聚糖 凝胶树脂对于标准（Std)DE分析的敏感性不具有负面影响。StdDE分析能够在临床相关标 本浓度下提供药物敏感性结果。
[0234]表7
[0235]
阳23引连施例8-檢测混合流威梳本中的杭药忡
[0237] 各种稀释度的标本W抗病毒药物奥司他韦使用动态流分析来分析。标本包括 八\贝塞斯达（Bethesda)做N2R) ;A\福井（F址ι?)做N2巧讯混合物4\贝塞斯达（V)+A福 井（WT)。使用光电倍增管测量信号，且测定抑制值。结果概述于图10中。运些结果展示 Std双酶AST检测化学方法在使用伴W单一光子检测的PMT且应用背景减除区分流感A与 流感B(允许应用最适当抑制值）的分析之后可W鉴别抗药株（当存在于具有药物敏感株 的标本中时）。 。23引连例例9-双酶分析的比巧
[0239] 此实施例比较两种类型的双酶分析的灵敏度。各种稀释度的纯化流感册N2神经 氨酸酶用包括W下任一的双重酶分析来分析：（1)作为巧光素酶的前体抑制剂（NANA-CF3 ; 参见图11)的神经氨酸酶底物；和（2)作为巧光素酶的前体底物（N-乙酷基神经氨酸和巧 光素的缀合物）的神经氨酸酶底物。神经氨酸酶活性将NANA-CF3裂解为醋酶抑制剂CFC。 在醋酶包括巧光素酶的分析中，神经氨酸酶活性导致存在CFC抑制剂，其抑制巧光素酶活 性，导致巧光素酶底物转化为发光产物的减少。参见图12。分析结果显示于图13中。分析 (1，双酶分析w/经遮蔽抑制剂）的检测水平化0D)为约lOpM。相比之下，分析（2,标准双 酶分析）的检测水平小于0.IpM。 阳240] 连施俩I 10-背景信号的对照的影响
[0241] 此实施例表明如实施例1的式中所述的减除背景水平在计算存在抗病毒药物情 况下的神经氨酸酶活性的抑制值中的影响。用如实施例1的特定抗病毒药物测定各种浓度 的特定病毒株的抑制值，使用下式测定来自含有反应混合物+标本+测试抗病毒药物（左 药物信胤下的测试)和反应混合物+标本(无药物信胤下的测试）的室信号在无背景减除 情况下的抑制值：
[0242]
[0243] 结果显示于表8中。在表8中，从左到右的柱为来自减小的病毒浓度的结果。在 抑制值计算中减除背景水平（如实例1中所示）增加分析的灵敏度。
[0244]表 8
[0245]
[0246] 如本文所用的术语"包含"与"包括"、"含有"或"特征在于"同义，且为包括性的或 开放式的且不排除额外未叙述的要素或方法步骤。
[0247] W上描述公开本发明的若干方法和材料。本发明容易受到方法和材料方面的修 改，W及制造方法和设备方面的更改。从本发明或本文中所公开的本发明的实践考虑，此类 修改可W对所属领域的技术人员变得显而易见。因此，并不打算将本发明限制于本文中所 公开的特定实施方式，但其涵盖在本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方案。
[024引本文中所引用的所有参考文献，包括（但不限于）已公开和未公开的申请、专利和 文献参考，均W全文引用的方式并入本文中且在此成为本说明书的一部分。在W引用的方 式并入的公开案和专利或专利申请与本说明书中所含有的公开内容相抵触的情况下，本说 明书打算替代和/或优先于任何此类矛盾材料。
【主权项】
1. 检测流感病毒的方法，其包括： (a) 使样品与适于检测A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析缓冲剂接 触，进而获得免疫分析测试样品； (b) 使所述免疫分析测试样品的第一部分与包括检测A型或B型流感的免疫分析的测 试物接触，进而检测所述样品中A型或B型流感的存在或不存在； (c) 使所述免疫分析测试样品的第二部分与包括神经氨酸酶分析缓冲剂的基质接触， 进而获得神经氨酸酶测试样品；和 (d) 使所述神经氨酸酶测试样品与神经氨酸酶分析物接触，进而检测所述样品中神经 氨酸酶的存在。2. 权利要求1所述的方法，其中所述免疫分析缓冲剂与用于神经氨酸酶活性的分析不 相容。3. 权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述免疫分析缓冲剂抑制神经氨酸酶活 性。4. 权利要求1到3中任一项所述的方法，其中步骤（c)和（d)在相同容器中进行。5. 权利要求4所述的方法，其中所述容器包括多个室。6. 权利要求4到5中任一项所述的方法，其中所述容器包括含所述基质的室，和包含用 于所述神经氨酸酶分析的试剂的室。7. 权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述基质包括交联多糖。8. 权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述基质选自葡聚糖凝胶和琼脂糖。9. 权利要求4到8中任一项所述的方法，其中所述免疫分析测试样品和所述神经氨酸 酶测试样品通过一个或多个选自重力、毛细作用和扩散的力在所述容器中移动。10. 权利要求4到9中任一项所述的方法，其中所述容器包括套筒。11. 权利要求4到10中任一项所述的方法，其中所述容器包括适于使用光电倍增器读 取的多孔套筒。12. 权利要求11所述的方法，其中所述光电倍增器选自光电倍增管和微光电倍增管。13. 权利要求11到12中任一项所述的方法，其中所述光电倍增器为便携式的。14. 权利要求11到13中任一项所述的方法，其中所述光电倍增器处于适合于初级护理 医师办公室的便携式读取器中。15. 权利要求11到14中任一项所述的方法，其中所述光电倍增管表面为圆形且具有约 6mm到9mm的直径，或所述微光电倍增管为矩形且具有约1mm到3mm的尺寸。16. 权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶分析包括测定神经氨 酸酶对测试化合物的敏感性。17. 权利要求16所述的方法，其中所述神经氨酸酶分析包括： (a) 获得抑制值比率，其中所述比率包括与不存在测试化合物情况下的所述神经氨酸 酶活性水平相比的存在所述测试化合物情况下的所述神经氨酸酶活性水平；和 (b) 比较所述抑制值与抑制阈值的比率，进而测定所述神经氨酸酶活性对所述测试化 合物的敏感性。18. 权利要求17所述的方法，其中所述抑制阈值通过检测A型或B型病毒测定。19. 权利要求18所述的方法，其中如果检测A型病毒，那么使用第一抑制阈值，如果检 测B型病毒，那么使用第二抑制阈值。20. 权利要求19所述的方法，其中所述第一阈值比所述第二阈值低。21. 权利要求17所述的方法，其中所述抑制阈值通过所述测试化合物测定。22. 权利要求17所述的方法，进一步包括选择用于治疗所述流感的所述测试化合物。23. 权利要求1到22中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶分析包括包含信号传 导酶的双酶分析。24. 权利要求23所述的方法，其中神经氨酸酶活性产生用于所述信号传导酶的底物。25. 权利要求23所述的方法，其中所述神经氨酸酶分析包括N-乙酰基神经氨酸和荧光 素或其衍生物的缀合物。26. 权利要求23所述的方法，其中神经氨酸酶活性产生用于所述信号传导酶的抑制 剂。27. 权利要求23所述的方法，其中所述神经氨酸酶分析包括N-乙酰基神经氨酸和三氟 甲基酮或其衍生物的缀合物。28. 权利要求23到27中任一项所述的方法，其中所述信号传导酶包括荧光素酶。29. 权利要求28所述的方法，其中所述免疫分析缓冲剂抑制荧光素酶活性。30. 权利要求1到29中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶活性水平使用光电倍 增管测量。31. 权利要求17到30中任一项所述的方法，其中所述测试化合物为抗病毒药物。32. 权利要求17到31中任一项所述的方法，其中所述测试化合物为选自以下的抗病毒 药物：奥司他韦（Oseltamivir)、扎那米韦（Zanamivir)、拉那米韦（Lanamivir)和帕拉米韦 (Peramivir)〇3