[0089]表巧在公用提取梳本h讲行流威A/B免巧分析巧药物易威忡测试的能力
[0090] 本文提供的一些实施方式包括表明哪些分析反应步骤/试剂在相同时间范围内 且很靠近（如果不在相同空间中）地进行时是相容地。在一些实施方式中，可W关于敏感 性、特异性、分析范围、解析和得到结果的时间（time-to-result)对用于核壳体的免疫分 析和用于神经氨酸酶活性的双酶分析密切监测。并非来自两种分析的所有步骤都需要相 容W取得成功。在一些实施方式中，威利特"免疫分析试剂和仙丽施QFluTM分析（当前部 署用于监测目的）中使用的当前双酶试剂用于所公开的方法、组合物、试剂盒、装置和系统 中。一种评估的试剂为用于两种分析的溶解试剂。在一些实施方式中，来自威利特TM免疫 分析的溶解试剂用于制备流感A/B和药物敏感性测试两者中使用的样品。在另一实施方式 中，使用来自仙丽施QFIuTm分析的溶解试剂W用于制备流感A/B和药物敏感性测试两者中 使用的样品。
[0091]杭病毒易威忡/杭忡分析的干扰筛洗
[0092]A和B型流感病毒具有表面糖蛋白，能够水解含有α-酬巧连接N-乙酷基神经氨 酸（有时称为化u5Ac)的底物的神经氨酸酶。评估用于神经氨酸酶基抗病毒易感性测试中 的底物包括由N-乙酷基神经氨酸和巧光素组成的混合分子（缀合物）。当巧光素在存在 巧光素酶情况下释放时，光W与标本中的残余神经氨酸酶活性成正比的量产生。在一个实 施方式中，评估用于仙丽施QFlu?组合试剂盒中的N-乙酷基神经氨酸-蛋火虫巧光素缀合 物，所述试剂盒当前分布用于监测应用。在一些实施方式中，用培养的病毒备料进行基准实 验化enchmakingexperiments)，借此对于每一测试条件进行两个分离反应，一个反应例如 含有抗病毒剂（实例：奥司他韦）且另一个神经氨酸酶活性测量在无抗病毒抑制剂情况下 进行。对照标本可W通过开发中的快速方法和推荐的WHOIC50方法中的一种分析。在一 些实施方式中，筛选抗病毒易感性试剂可W在微孔、管或比色杯或板中进行且读取化学发 光或巧光。筛选可W用流感的抗病毒抗性和敏感性株进行。当应急时，纯的神经氨酸酶可W 扎进标本中且用于干扰筛选中。冰冻的已知阳性临床标本也可定期（onaregularbasis) 测试，主要用W确保鼻拭出物的其它组分不干扰双酶分析。
[0093]免巧分析的干扰筛洗
[0094] 在一些实施方式中，流感检测（免疫分析）试剂的筛选可W侧流格式进行且读取 反射率，如当前在美国食品药物管理局批准的化IAWaived威利特"产品中所进行的。抓 威利特?免疫分析使用针对流感核壳体的两种单克隆抗体。一种抗体固定到专有金粒子 的表面而另一种固定到侧流盒中的硝化纤维素。硝化纤维素反应条带上检测的信号的量与 标本中流感病毒的量成比例。关于对威利特"免疫分析潜在干扰的测试双酶试剂可w在存 在制备的流感A(流感A/PR/8/34)和流感B(流感B/李化ee)/40)阳性样品的情况下进行 W产生对应于中度阳性的最终浓度（检测的约5倍水平）。测试干扰可W流感A或流感B 阴性样品情况下的假阳性结果或流感A或流感B阳性样品情况下的假阴性结果的形式被看 至IJ。仅不展现干扰的那些双酶试剂可W前进。当应急时，纯的核壳体可W扎进标本中且用 于性能筛选。
[00巧]其它双酶化学
[0096] 其它双酶试剂系统包括与包括N-乙酷基神经氨酸和巧光素缀合物组分的仙丽施 系统类似但利用不同连接体的底物。在一些实施方式中，可W使用不同巧光素酶。
[0097]测定用于药物易威忡分析的格式/一次忡物品
[0098] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括选择用于组合分析的适当格式。在 发现化学性质相容的一些实施方式中，随后免疫分析和双酶分析的完整执行可W侧流格式 最佳地处置。当侧流格式用于两个分析时，通过相同提取试剂处理的标本可W加载于侧流 样品垫上，且片刻之后，可W关于流感（包括A/B型）的存在读取侧流盒的终端，且也可W 提供基于药物易感性的疗法推荐。反射率测量结果可W直接获自用于流感检测的侧流膜且 获取化学发光测量结果W用于药物易感性。在一些实施方式中，可W使用定量"场上"化学 发光测量结果的便携式冷却型CCD相机。
[0099] 在一些实施方式中，其中双酶分析中的第一酶反应与其它免疫分析试剂不相容， 双酶分析的前端离线进行且具有裂解底物的经部分处理的标本加载到侧流样品垫上，其可 W通过毛细作用沿侧流条带下行到含有巧光素酶和其它产生发光信号必需的试剂的固体 载体。
[0100] 在一些实施方式中，侧流的双酶分析可W通过将含有裂解巧光素的经处理侧流盒 的部分浸没到具有巧光素酶和其它产生发光信号所需要的试剂的孔中实现。产生自双酶分 析的光随后通过LuminoskanTLPus或等效光度计测量。
[0101] 在一些实施方式中，免疫分析在侧流盒上进行和读取且流线型仙丽施QfluTM组 合分析在孔条带上进行和读取。两个分析可W共用公用提取标本，但W不同格式执行，随后 在可W调节侧流反射率和孔条带化学发光的公用仪器上读取。在一些实施方式中，使用两 个独立仪器。在一些实施方式中，单个或多个装置为便携式、电池供电装置，具有小的占据 面积，适合放置于医生办公室中，例如设计尺寸W适配于柜台或便携式医用置物架上。 引系统輪证
[0103] 可W培养和列举20个流感株的测试集，允许最终组合平台（整合的一次性物品、 读取器和试剂）分析下至10E3病毒体（WTCIDw/ml或CEIDw/ml单位界定）的浓度的敏 感性。20个株的测试集可W含有平衡的流感A和B株。流感A株可W是流感H1N1和H3N2 的混合物。测试集可W含有特敏福（Tamiflu)?抗药和易感性株。测试集也可W包括对第 二MI药物具抗性的和易感的株。为了进展和最终整合系统进行基准测试，可使用几乎100 个冷冻的已知阳性临床分离株。 W04] 用于开发巧輪证的杭病毒剂
[0105] 表1提供用于本文提供的方法和组合物的示例性NAI(神经氨酸酶抑制剂）抗病 毒剂。由于群体无法依赖于新循环流感株始终对奥司他韦和扎那米韦具有敏感性，用生物 区度iota)药物在POC抗病毒易感性诊断中产生数据期望的。
[0106]表1
[0107]
。…引 流威株、分离株巧对照集合
[0109] 表2包括用于本文提供的方法和组合物的一些实施方式的示例性特异表现型和 基因型。可W获得对于神经氨酸酶药物具抗性和易感性的流感A和流感B株度SL-2)W用 于发展。在一些实施方式中，本文提供的方法和组合物包括主要流感A亚型神经氨酸酶，W 及流感B神经氨酸酶。
[0110] 表 2
[0111]
。…]基准测试
[0113] 本文提供的一些实施方式包括对于单点QFlu?组合和免疫分析进行IC50。威利特 TM和QFIuTm系统可根据包装说明书使用。针对IC50制备的试剂盒存在许多选项，如来自应 用生物系统公司/生命技术公司化ifeTechnologies)的NA-Star?试剂盒。表3提供可 用于抗病毒测试的供应品的来源和料号的实例。
[0114]表 3 [011 引
。"引 1(?方法
[0117] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式可W与用可商购的NA-Star?试剂盒 (加利福尼亚州福斯特市（FosterCity,CA)应用生物系统公司）进行的化学发光NAI分析 比较，所述试剂盒包括NA-Star?缓冲剂（26mMMES，4mMCaClz，抑6. 0)、NA-Star愈底物、 ΝΑ-star?'促进剂和96孔固体白色培养板。目录4374348和4374349。ICs。方法、制备和分 析的其它细节可W见于抗菌剂和化学疗法（ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOT肥RAPY)， 2008年9月，第3284-3292页第52卷，第9期中，其W全文引用的方式并入本文中。 阳m]梳本洗择（巧m物巧对于滿絡物巧对于抽m物）巧对分析敏威忡的影响[0119] 一些实施方式包括Ξ个标本选项（来自拭出物的直接测试相对于来自鼻咽洗涂 物或抽出物的测试）。一些实施方式包括来自冷冻标本和培养物的测试，和从单一集合进行 核壳体免疫分析和神经氨酸酶活性分析的能力。 阳120] 育接从巧m物测试
[0121] 本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括使用拭子收集标本。第一威利特TM 免疫分析是基于干燥拭子集合，借此整个标本有意提交到"加工试剂"(400μ1体积）且药 品说明书要求（call化r)标本在一小时内施用到侧流条带。通常，在约80μ1体积加载到 侧流盒上之后残留数百微升，留下大量未使用的经处理抗原，其可W被引导到抗病毒易感 性测试。尽管此标本处理路径并未分出用于病毒培养的样品，在一些实施方式中，免疫和动 态分析均可W在其峰值检测水平处或附近进行，其中剩余一些标本，其可W补充有核酸稳 定剂W用于随后PCR检测。 阳12引测试鼻晒滿絡物/抽m物
[0123]威利特TM平台包括运样的方法，其中浓缩粘液溶解（mucolytic)试剂在负载于侧 流盒上之前W3份比1份添加到收集的标本。立百\微升的每一有机体悬浮液添加到含有 如由抓销售的RV试剂C或RV试剂D的组合管（utilized化be)(例如，在用于快速诊断流 感A&B的威利特TM系统的试剂盒（产品号256045)中）。大于10种保存-运送培养基已在 运些洗涂物/抽出物标本的情况下成功地测试。保存-运送培养基的实例包括：M4RT、M4、 M5、UTM、艾姆斯（Ames)培养基（液体）、己特尔维拉特兰斯度artelViraTrans)?培养基、 汉克斯（Hanks)平衡盐溶液、标准生理盐水、憐酸盐缓冲盐水。M4RT培养基在25°C下为抑 7. 3 且含有汉克斯平衡盐：CaCl2、MgCl2-6H2〇、Μ拆〇4-7&0、KC1、KH2PO4、NaCl、胞2册〇4-7&0、 葡萄糖。因此，在一些实施方式中，用于病毒传播的样品可W在添加粘液溶解剂之前收集有 鼻咽洗涂物/抽出物。可能的抗原稀释影响可W在使用鼻咽洗涂物/抽出物标本时考虑在 内。威利特?分析比市场上的任何其它快速分析具有更大敏感性。 阳124] 巧取敏威忡的化学发化方法巧麼量
[0125]用于本文提供的方法和组合物的化学发光方法包括美国专利第8, 221，976号；第 8, 163, 237 号；第 7, 947, 820 号；第 7, 642, 060 号；第 7, 291，488 号；第 5, 736, 365 号；第 5, 639, 428 号；第 5, 561，044 号；第 5, 518, 884 号；第 5, 470, 723 号；第 5, 457, 027 号；第 5, 314, 801号；第5, 017, 473号；和第4, 810, 631号中所公开那些，所述专利中的每一个W 全文引用的方式并入。在一些实施方式中，双酶测试的度量大体类似于诸如使用威利特TM 免疫分析获得的流感病毒体的检测水平的度量。在一些实施方式中，检测神经氨酸酶的存 在的化学反应可W在l〇3TCI^。处产生足够信号W也允许在用药物与w\o药物进行的反应 之间将观测到的稳固5 :1比率。在一些实施方式中，敏感性和长线性范围均可评估。在 一些实施方式中，可W使用仙丽施。 阳12引 某処化学
[0127]图12显示可W与本文中提供的组合物和方法一起使用W分析神经氨酸酶活性 的醋酶基化学反应。用于本文提供的方法和组合物的实施方式的方法包括w下所公开 的那些：迈兹（Mize)等人，双酶级联值ualEnzymeCascade),分析化学（Anal}ftical Chemistry)，179,（1989)第 229 至 235 页；美国专利 4, 904, 583 ;美国专利 4, 835, 099,其各 自W全文引用的方式并入本文中。一些实施方式包括经修饰巧光素酶和其底物，如经修饰 神经氨酸-巧光素缀合物。可W使用的其它抑制剂包括W下：
[012引
[0129] R=Η醋酶抑制剂
[0130] R=ΝΑΝΑ经遮蔽醋酶抑制剂
[0131] 一些可能的Bets-硫基变体抑制剂/经遮蔽抑制剂
[0132]
[0133] 图12中的化合物在对位具有Ξ氣酬。更多醋酶抑制剂包括1，1，1-Ξ氣-4-(4-? 基苯基）下-2-酬（对位）；1，1，1-Ξ氣-4-(3-?基苯基）下-2-酬（间位）；和1，1， 1-Ξ氣-4- (2-径基苯基）下-2-酬（邻位）。
[0134] 用于本文中公开的实施方式的可选经遮蔽抑制剂底物包括在间位和邻位具有Ξ 氣酬的那些，如下文所提供：
[0135]
[0136] 在另一实施方式中，4, 7甲基化N-乙酷基神经氨酸（NANA)-Ξ氣酬可W在对于流 感神经氨酸酶更多特异性的情况下用于DE经遮蔽抑制剂分析。
[0137] 一些实施方式包括用于双酶流感神经氨酸酶敏感性分析的经遮蔽抑制剂化合物， 其具有式（I)结构：
[013 引
[01測其中办、护和33各自独立地为氨或(：15烷基讯为0、1、2或3;1?%-畑2)">"= 0)CF3;m为 0 或 1;X为-S做或-CH(R5) - ;R5 为-S(0),邸3;且Z为 0、1 或 2。
[0140] 在一些实施方式中，式（I)化合物选自W下：
[0141]
[0142]
[0143]
阳144] DM郷I序
[0145] 在一些实施方式中，基因型数据获自标本的流感病毒体。在一些实施方式中，特定 病毒分离株可W用基准组织培养IC50方法产生不同于来自快速P0C测试的曲线（profile) 的药物敏感度曲线。不同曲线可归因于神经氨酸酶活性位点内的残基处的突变和已知赋予 NA中的其它地方的特异性流感亚型或框架取代的抗性。对来自标本的核酸进行测序的方法 在本领域中是众所周知的。 。"引夹自其它病原体的干扰
[0147] 在一些实施方式中，设想来自疑似患有流感感染的患者的一些标本可化含有产生 神经氨酸酶的其它病原体。表4提供最常发现于流感阳性临床标本中的病原体的实例。
[014引表4
[0149]
[0150] 表5提供可W在标本干扰测试中测试的病原体的实例。可W测试此类病原体对本 文提供的方法和组合物的任何影响。干扰在全病毒或纯化神经氨酸酶情况下测试。运些病 原体可W在预期存在于临床集合中的浓度下分析。
[0151]表 5
[0152]
[0153] 在一些实施方式中，样品可包括鼻咽洗涂物、抽出物和拭出物。 阳154] 檢郷I A巧流威或B巧流威
[0155] 本文提供的实施方式中的一些包括检测标本中A型流感病毒或B型流感病毒的存 在。一些实施方式包括使用免疫分析鉴别可W区分流感类型，如A/B的病毒抗原。在一些实 施方式中，抗原为核壳体。在一些实施方式中，免疫分析包括夹屯、分析。在一些此类实施方 式中，第一抗体特异性结合到目标抗原，且结合的抗原和第一抗体随后特异地结合到产生 信号的第二抗体。在一些实施方式中，信号为比色、巧光、化学发光和放射性的。在一些实 施方式中，免疫分析可W包括侧流系统。在一些实施方式中，测试条带包括免疫分析。用于 本文提供的方法和组合物的系统和组合物包括用于快速检测流感A+B的威利特?系统（百 克顿-迪金森公司）。在一些情况下，来自测试条带的输出将为反射率。在一些实施方式 中，来自测试条带的输出为可W使用反射率读取器测量的颜色改变。除侧流免疫分析格式 W外，测定A型或B型流感病毒的实施方式可W包括在溶液相中、在基底如膜、表面和粒子 上的分子和免疫检测。在一些实施方式中，微孔化ISA、纳米标签-磁性分离分析和粒子凝 集。分子检测分析的实例包括Xpeit吸流感系统（加利福尼亚州森尼韦尔市赛沛（Cephied， Sunnyvale,CA))。包括纳米标签的实施方式包括表面增强拉曼光谱测学（SE：R巧纳米标签。 参见例如美国化学学会?纳米（ACSNano) ,2009, 3 (10)，第2859-2869页，其W全文引用的 方式并入本文中。包括粒子凝集的实施方式为众所周知的且包括使流体中的抗原与抗原结 合要素，如包被于粒子上的抗体接触。参见例如U.S. 4, 590, 169,其W全文引用的方式并入 本文中。
[0156] 本文提供的实施方式中的一些包括在包括非免疫分析方法的标本中检测A型流 感病毒或B型流感病毒的存在。在一些实施方式中，A型流感病毒或B型流感的存在可W 使用基于核酸的方法，如PCR、核酸杂交和核酸测序检测。 阳157] 测量神经氨酸酶活忡
[015引本文提供的一些实施方式包括检测和/或测量样品中的神经氨酸酶活性。在一些 实施方式中，神经氨酸酶为病毒神经氨酸酶，如A型或B型流感神经氨酸酶。在一些实施方 式中，检测的酶为唾液酸酶。在一些实施方式中，神经氨酸酶活性可W使用双酶分析测量。 用于本文提供的方法和组合物的一些实施方式的试剂包括QFlu?NI分析（马里兰州仙丽施 公司（Cellex,Inc.，Ma巧land))和QFlu?组合分析的那些。
[0159] 在一些实施方式中，神经氨酸酶的底物转化为第二酶，如醋酶，如巧光素酶的底 物。在一些