8%判为阳性；PK 22. 08%判为阴性；22. 08% < PI < 3L 88%判为可 疑。
[0088] 实施例5
[0089] 阻断ELISA方法性能评价：
[0090] (1)特异性试验：采用初步建立的阻断ELISA检测方法对禽大肠杆菌病、禽沙门 氏菌病、禽白血病、鸡球虫病、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病阳性血清为参照血清，产气 荚膜梭菌阳性血清作为阳性对照。根据已确立的临界值进行判断，分析有无交叉反应。结 果显示，只有产气荚膜梭菌阳性血清检测为阳性，其他血清均为阴性，统计学结果也表明 检测产气荚膜梭菌阳性血清时的OD 49tlnm值与检测其他参考血清的数值表现差异极显著（P <〇.〇1)，说明本实验建立的检测体系特异性良好，无交叉反应，见图12。
[0091] (2)灵敏性试验：将兔抗NetB毒素血清用PBS缓冲液分别作1 : 40、1 : 80、 1 : 160、1 : 320、1 : 640、1 : 1280和1 : 2560倍稀释，按阻断ELISA程序进行，同时设 立阴性对照，根据阳性临界值判定，以最高稀释度为单抗检测的灵敏度。已知本批次兔抗产 气荚膜梭菌NetB毒素多抗血清的浓度为2. 4mg/ml。在阴性对照成立的情况下，根据确定的 阳性临界值，所能检测多抗的最高稀释倍数为1 : 320,此时抗体浓度为0. 0075mg/mL，说明 阻断ELISA方法最低可以检测到0. 0075mg/mL的抗体，见表1。
[0092] (3)重复性试验：批内重复实验，包被同一批蛋白，根据建立的方法选取4份血清 连续4天对每份样品进行检测。批间重复实验，用2种不同批次的蛋白包板，选取4份血 清根据建立的方法连续3天对每份样品进行检测。这两个重复性试验的变异系数都小于 10%，证明本实验建立的阻断ELISA检测方法具有良好的重复性，见表2-3。
[0093] 表1阻断ELISA敏感性试验
[0094]
【主权项】
1. 一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征在于所述检测方法 步骤如下： 一、阻断ELISA检测方法的建立 (1) 用包被液将产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白稀释至5yg/mL，100yL/孔包被96 孔酶标板，4 °C过夜； (2) PBST溶液洗涤3次，加入封闭液200yL/孔，37°C孵育2h; (3) PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，同时设置阴性和阳性对照，阳性对照为NetB毒 素多克隆抗体，阴性对照为阴性血清，100UL/孔，37°C孵育1. 5h; (4) 3次PBST溶液洗涤后，将抗产气荚膜梭菌NetB毒素的F9G3单克隆抗体用PBS缓冲 液稀释至 〇. 635yg/mL，100yL/ 孔，37°C反应lh; (5) PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1 : 5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠 IgG抗体，37°C孵育lh，PBST溶液洗涤3次； (6) 最后加入显色液100yL/孔，室温条件避光反应lOmin，用2MH2SO^§液终止反应， 490?处读取吸光值； 二、 结果判定标准的确定 计算CP阴性样品平均值（Q与标准差（S)，求得（I)+3(S)为阳性临界值， (I) +2(S)为阴性临界值；当样品阻断率PIS(I)+3(S)，则血清样品判为阳性；当 PIS( 7)+2(S)时为阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测一 次，如仍可疑则判定为阳性。
2. 根据权利要求1所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特 征在于所述包被液为0. 05mol/L碳酸盐包被缓冲液，其配制方法如下：称取Na2C03l. 5g、 NaHC032. 93g，调节pH至9. 6,加蒸馏水至1000mL，4°C保存。
3. 根据权利要求1所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特 征在于所述PBST溶液为含0. 05 %Tween-20的PBS溶液，其配制方法为：称取NaCl8g，KC1 0? 2g，Na2HP04 ? 12H20 3. 58g，KH2P040. 27g，加蒸馏水至lOOOmL，调至pH7. 4 ;再加入 0? 5mL Tween-20。
4. 根据权利要求1所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征 在于所述封闭液为PBS溶液稀释的1 %BSA。
5. 根据权利要求4所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征 在于所述含1%BSA的PBS溶液的配制方法为：每100mlPBS溶液中加lgBSA。
6. 根据权利要求1所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征 在于所述NetB毒素多克隆抗体的工作浓度为30yg/ml。
7. 根据权利要求1或6所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法， 其特征在于所述NetB毒素多克隆抗体的制备方法如下：选取2-3Kg新西兰大白兔，首免为 纯化的NetB毒素重组蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射，剂量为 2mg/只，首免2周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的NetB毒素重组蛋白完全乳化，剂量 为lmg/只，每周免疫1次，3免后1周用不加佐剂的纯化的NetB毒素重组蛋白加强免疫1 次，7d后兔心脏采血获得血清，得到抗产气荚膜梭菌NetB毒素多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征 在于所述NetB毒素单克隆抗体的制备方法如下： a、 产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白免疫BALB/c小鼠： 选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物，以纯化和复性后 的NetB毒素重组蛋白为免疫抗原，首次免疫时取50yg纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进 行乳化，采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；3周后取50yg纯化蛋白与 等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫；此后每隔2周进行一次免疫，免疫剂量和免 疫途径与第二次免疫相同，最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合； b、 细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选： 取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG3350 进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3-5次 亚克隆，得到分泌抗产气荚膜梭菌NetB毒素的杂交瘤细胞株F9G3 ; c、 单克隆抗体腹水的制备： 选用8周龄、健康、雌性BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡致敏，0. 5mL/只，7d后注 射杂交瘤细胞；收集对数生长期杂交瘤细胞，l〇〇〇r/min离心lOmin，弃去上清，向细胞沉淀 中加入5mL不完全1640培养液，将细胞悬起，1000r/min离心lOmin;弃去上清，用不完全 1640培养液悬起细胞，细胞悬液100倍稀释后进行细胞计数，调整细胞密度为10 6个/mL，每 只小鼠腹腔注射〇. 5mL此密度的细胞悬液；注射后7d开始观察小鼠腹部状态，待小鼠处于 平卧状态下腹部两侧明显膨大时，使用酒精棉球消毒腹部皮肤，用10mL注射器针头刺入腹 部皮肤，无菌离心管收集从针头流出的淡黄色或暗红色液体；4°C、3000r/min离心15min， 弃去上层的脂肪，注射器收集中间层的淡黄色液体即为腹水，-20°C保存备用； d、 辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水： 向预处理的腹水中加入两倍体积0. 06mol/L醋酸盐缓冲液，均匀搅拌；每份腹水中 加入三倍体积的正辛酸搅拌30min，4°C静置2h小时以上；将上述溶液取出llOOOrpm离 心30min，弃沉淀，上清用2mol/LNaOH调pH至7. 4 ;4°C条件下加入饱和硫酸按至50%饱 和度，冰浴搅拌作用30min，4°C静置2h以上；llOOOrpm离心30min，弃上清，沉淀溶于5ml 0. 1MpH为7. 4的PBS中；上述溶液边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度 为30-40%，冰浴搅拌作用301^11，41：静止211以上 ；11000印111离心301^11，取沉淀，将沉淀融 入2mL0? 1MpH为7. 4的PBS中；将上述悬浮液装入透析带中，用0? 1MpH为7. 4的PBS4°C 透析，2h换液一次，透析2d，纯化后腹水即为抗产气荚膜梭菌NetB毒素的F9G3单克隆抗 体，-80 °C保存备用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，用于产NetB毒素产气荚膜梭菌感染的早期检测，为产气荚膜梭菌病的特异性诊断和综合防治及后续科学研究提供有效的检测工具。所述阻断ELISA方法包括以下两个步骤：一、阻断ELISA检测方法的建立；二、结果判定标准的确定。本发明建立了一种快速、敏感和特异的阻断ELISA方法来检测产气荚膜梭菌感染血清中NetB毒素的特异性抗体，有望成为临床产气荚膜梭菌病快速诊断和免疫检测的重要工具，必将在产气荚膜梭菌病的诊断和防治中发挥重要作用，具有很好的应用价值。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-569
【公开号】CN104807992
【申请号】CN201510201521
【发明人】李广兴, 聂思静, 王莹莹, 任玉东, 乔艺然
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月25日