草甘膦检测微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种草甘膦检测微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及检测方法。
【背景技术】
[0002]草甘膦(Glyphosate，GLY)作为除草剂，经近年来许多研宄表明草甘膦对生物具有一定的毒性，草甘膦进入环境会对生态环境产生有害影响，引起水污染，植被破坏，并通过在食物中的残留对人类健康构成威胁，并在遗传方面产生不良影响。因此我国2006年颁布的《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)规定饮用水中草甘膦的含量不得超过
0.700mg/Lo《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750— 2006)中草甘膦的检测采用的是柱后衍生离子交换色谱法，在色谱柱后增加自动衍生设备，操作繁琐且不易掌握。
[0003]目前有关草甘膦残留分析方法主要采用液相色谱和气相色谱法，另外还有液-质联用、气-质联用和离子色谱法等。但由于草甘膦极性强，易溶于水，难溶于大多数有机溶剂，没有发色和突光基团等特性，使得气相色谱法常用的各种标准衍生技术的使用受到限制。利用色谱法进行草甘膦残留检测实验操作复杂、难度大，无法满足生产实践中草甘膦快速检测的需要。
[0004]中国专利200910247555.5公开了一种基于免疫反应的生物检测微流控芯片及其备做方法。该芯片以光学透明的聚二甲基硅氧烷为材料，由样品通道层，阀门控制层及基片层构成。芯片内含样品富集及免疫分析模块，该模块由一个或几个纳升体积的免疫色谱柱微分析室组成，每个分析室固定有抗体蛋白或抗原。该微流控芯片存在制备程序复杂，检测需要复杂的信号采集模块、微处理器及数据库，检测设备成本高昂，也使用了色谱分析方法，检测程序复杂，难度大，检测速度慢。
[0005]免疫分析法(Immunoassay, IA)是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础来获得定性或定量结果的微量检测技术。与传统的微量检测方法相比，具有特异性好、灵敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、适于现场测定等优点。但是免疫检验通常在96孔板上进行，样品和试剂消耗量大，且抗原-抗体的结合时间长，这些不足限制了其进一步的应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种草甘膦检测微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及检测方法，使微流控芯片能够简便、快速、准确检测水中的草甘膦。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的一种检测草甘膦的微流控芯片，包括位于底部的基片和密封覆盖于其上的盖片，基片上设置有微流路，所述微流路包括衍生化通道和与其相连的免疫反应检测通道，免疫反应检测通道内表面固定有草甘膦抗原，在衍生化通道的入口设置有水样入口和衍生试剂入口，在免疫反应检测通道出口设置有废液出口，在衍生化通道与免疫反应检测通道连接处附近设置有磷酸盐缓冲液入口、草甘膦抗体溶液入口、Cy3荧光染料标记二抗溶液入口和十二烷基磺酸钠溶液入口。
[0008]作为优选，所述基片和盖片的材料为玻璃片，微流路采用光刻的方法刻出。
[0009]作为优选，所述基片与盖片采用热键合技术键合。
[0010]作为优选，所述衍生化通道设置成蛇形曲折通道。
[0011]作为优选，所述免疫反应检测通道深40um，宽度为150um，长度为35mm。
[0012]为解决上述技术问题，本发明的一种草甘膦抗原固定方法，应用于权利要求1所述的草甘膦检测微流控芯片，通过对微流控芯片的免疫反应检测通道内表面进行化学修饰引入活性基团，再使免疫反应检测通道内表面上的活性基团与草甘膦抗原活性基团结合，从而使草甘膦抗原固定在免疫反应检测通道的内表面上。
[0013]作为优选，所述免疫反应检测通道内表面的化学修饰步骤如下:
[0014](I)用体积比为1:1甲醇和盐酸的混合液在超声波清洗机中超声清洗微流控芯片30min,去离子水清洗后吹干；
[0015](2)将体积比为7:3的硫酸和双氧水的混合液通入到芯片通道内，静置30min，使通道表面将产生羟基，反应结束用去离子水冲洗，再用氮气吹干芯片；
[0016](3)将体积比为1:9的3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙酮的混合液通入到芯片通道内，50°C反应24h，使芯片内表面氨基化，用去离子水清洗后60°C干燥2h，将含有过量戊二醛的磷酸缓冲液通入芯片通道内中，4°C反应lh，20°C反应lh，反应结束后用去离子水冲洗干净。
[0017]作为优选，所述使免疫反应检测通道内表面上的活性基团与草甘膦抗原活性基团结合的步骤如下:
[0018](I)将草甘膦加入到7.5ml 0.1M的4-吗啉乙磺酸缓冲液中，使溶液中草甘膦浓度为0.019mM ;同时将200mg牛血清白蛋白溶解到5ml 0.1M的4-吗啉乙磺酸缓冲液中；将39mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺用0.1M的4-吗啉乙磺酸缓冲液配制成0.019mM溶液；将上述三种溶液混合后室温下反应2h，用分子截留量为6000-8000的Spectrapor I透析膜在4°C下持续透析24h ；
[0019](2)将250 μ L浓度为lmg/ml透析后的草甘膦-牛血清白蛋白溶液通入免疫反应检测通道，4°C下反应24h，通入2mg/ml牛血清白蛋白溶液，静置20min，磷酸盐缓冲液清洗，
氮气吹干。
[0020]为解决上述技术问题，本发明的一种草甘膦检测方法，采用权利要求1所述的微流控芯片检测草甘膦，该检测方法包括如下步骤:
[0021 ] (I)同时抽取水样和衍生试剂琥珀酸酐，在衍生化通道中，使水样中的草甘膦与衍生试剂琥珀酸发生反应，从而对水样中草甘膦进行衍生；
[0022](2)将衍生后的水样与草甘膦单克隆抗体泵入到芯片免疫反应检测通道，37°C条件下孵育15min，使水样及免疫反应检测通道上固定的草甘膦竞争性结合溶液中抗体结合位点；
[0023](3)泵入Cy3荧光染料标记的二抗，37°C条件下孵育15min，抗体与二抗发生免疫反应，形成草甘膦-抗体-二抗复合物；
[0024](4)用磷酸盐缓冲液清洗芯片免疫反应检测通道，将没有结合在芯片上的复合物冲出检测通道，用光电倍增管检测荧光读数F，根据用不含草甘膦的去离子水空白对照测得的荧光值Fe和公式F' = (Fc-F)/Fe计算得到F'，通过该微流控芯片关于样品中草甘膦浓度C与相对荧光强度F'的线性方程计算出水样中的草甘膦浓度C。
[0025]作为优选，将检测后的微流控芯片用pHl.9浓度5%的十二烷基磺酸钠溶液清洗，使抗体变性后脱离芯片上的草甘膦固定抗原，实现微流控芯片再生使用。
[0026]本发明一种草甘膦检测微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及检测方法的有益效果是:
[0027](I)本发明中将免疫分析和微流控技术结合，利用了免疫分析法具有的特异性好、灵敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、适于现场测定等优点，也利用了微流控芯片具有的分析速度快，工作效率高、试剂耗量少、系统高度集中、自动化程度高等优点，不仅提高了检测的灵敏度和准确性、抗原与抗体的反应速度，也降低了样品和试剂的消耗量，能够简便、快速、准确检测水中的草甘膦。
[0028](2)采用玻璃片作为微流控芯片的材料，是由于玻璃片具有廉价、表面光滑、荧光背景低、性能稳定等诸多优点。微流路采用光刻的方法刻出，在于采用光刻的方法刻制方法简便，可以精确控制微流路的大小和深度，而且形状整齐规则。
[0029](3)基片与盖片采用热键合技术键合，可以实现基片与盖片的严密密封，保证微流路流动的准确有效性，并防止杂质的带入，避免影响检测结果。
[0030](4)将衍生化通道设置成蛇形曲折通道，是为增加衍生试剂与草甘膦接触时间，使水样中的草甘膦能够完全被衍生化，提高检测的准确性。
[0031 ] (5)将免疫反应检测通道设置成深40um，宽度为150um，长度为35mm，可以使草甘膦抗原充分的固定在免