一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，提取花粉混合菌悬液DNA，用根据猴桃Psa的hrpW基因设计两对引特异性引物，进行巢式PCR，从花粉样品中扩增获得大小为590bp左右的外引物扩增和240bp左右的内引物扩增条带，经测序验证为Psa，本发明检测灵敏度为103cfu/mL，本发明建立了特异性更强、稳定性更高、灵敏度较高的Psa快速检测方法，不仅能够区分Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae等与Psa亲缘关系较近的病原菌，也能区分致病能力弱的Psa，减少了假阳性的出现。
【专利说明】
一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及果蔬病害检测技术领域，具体涉及一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来猕猴桃溃疡病(kiwifruit bacterial canker)的大面积爆发导致猕猴桃 产量下降，严重影响产业发展。猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种 (Pseudomonas syingae pv. actinidiae，Psa)引起的细菌性病害。病原菌借助昆虫、风雨等 自然条件，自主侵染猕猴桃植株的嫩芽、枝条的落叶痕、新生的分叉、叶片的皮孔、气孔等或 营养较差的以上组织，随后扩散入果树各枝蔓造成整棵植株染病;或通过修剪伤口、冻裂伤 口进行传播。
[0003] Gal lei 1 i . A等（2011)通过分子检测技术发现意大利的猕猴桃花粉中存在溃疡病 病原菌;Stefani.E等(2011)也从花粉中检测到Psa的存在，认为花粉是导致猕猴桃溃疡病 传播的主要原因之一，新西兰学者认为新西兰目前大规模流行的PSA-V(强致病力菌株)病 原菌是由于进口国外带菌花粉而引进的。Psa的检测主要是采用传统的检测技术，但传统方 法费时费力，而且特异性不高。近几年一些基于PCR的分子检测方法已经建立起来，这些分 子检测方法更加快速，而且特异性更高。但由于Psa与其同属的（Pseudomonas syringae pv. Theae)及(Pseudomonas avellanae)亲缘关系非常近，常规的分子标记技术很难将它们 区分开，而且Psa本身的遗传多样性也非常丰富。世界Psa主要分为三大类群，我国流行的猕 猴桃溃疡病的Psa与最近在意大利、新西兰、西班牙、法国、葡萄牙等主要猕猴桃园流行的 Psa为同一类群。通过一些学者的研究发现使用普通PCR检测Psa易出现假阳性或假阴性。由 Psa引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害，一旦果树发病没有有效的药剂可以 医治。因此研究出花粉中Psa的检测方法，对控制猕猴桃花粉中Psa的传播具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种猕猴桃花粉中Psa的检测 方法，降低检测成本，提高检测效率。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，包括以下处理步骤：
[0007] a)根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
[0008] b)进行猕猴桃花粉Psa的培养富集；
[0009] c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA;
[0010] d)进行巢氏PCR扩增；
[0011] e)对PCR产物进行电泳检测。
[0012]进一步，所述步骤a)巢氏PCR引物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因 的保守序列设计的，外引物、内引物的扩增长度分别为590、240bp。
[0013]进一步，所述步骤b)猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为:称取猕猴桃花粉0.01g，加 入装有15mL已高压灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培 养箱中24°C、180r/min培养12h后，4°C保存待用。
[0014]进一步，所述的步骤c)提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为:取lmL过夜培养的菌悬 液于1.5mL离心管中，室温，11，OOOrpm离心lmin，弃上清液，收集菌体;将收集的菌体加入 lmL灭菌ddH2〇反复吸打，洗涤菌体，11，OOOrpm离心lmin，弃上清液，重复洗涤一次，取100yL 灭菌ddH20，反复吸打，溶解沉淀，于100 °C水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8， OOOrpm离心lmin，取上清液，-20 °C保存备用。
[0015] 进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增体系为：总体积25yL，其中2 X PCR Master 12.5yL，1 Ομπιο 1 /L的上游引物 1 yL，1 Ομπιο 1 /L的下游引物 1 yL; DNA模板 1 yL; ddH20 9.5yL;其 中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩 增的PCR产物稀释50倍。
[0016] 进一步，所述的步骤d)巢氏PCR扩增程序为：首先94°C变性5min;其次进行35个循 环反应，包括94°C变性10sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin;最后72°C延伸10min，4°C保 温。
[0017] 进一步，所述的步骤e)PCR产物电泳检测方法为:PCR反应结束后，取5yL PCR产物 点样于1 %的琼脂糖凝胶中，选用2000bp DNA Marker;电泳选用1 X TAE缓冲液，条件为：电 压100V，电流60mA，电泳25min，电泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[00?9 ]根据猕猴桃优势P s a的hr pw基因设计巢氏PCR引物，进行检测能区分与P s a亲缘关 系非常近的Pseudomonas syringae pv.Theae及Pseudomonas avellanae，减少假阳性的出 现;巢氏PCR扩增既能增强检测的特异性，也能增强检测的灵敏度;猕猴桃花粉Psa的培养富 集仅需4-12h，加上巢氏PCR扩增，检测时间只需要18h，而常规的Psa培养鉴定检测需要3-7 天;花粉菌悬液中Psa DNA的提取采用热裂解法，不仅可以降低检测成本，而且可以实现大 量样本同时操作，大大提高检测效率。
【附图说明】
[0020]图1是陕西猕猴桃Psa及相近病原菌hrpW基因巢式PCR扩增电泳图；
[0021 ]图2是猕猴桃Psa检测灵敏度电泳图；
[0022]图3是猕猴桃花粉Psa巢式PCR外引物扩增检测电泳图；
[0023]图4是猕猴桃花粉Psa巢式PCR内引物扩增检测电泳图
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例，对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0025]本发明猕猴桃花粉中Psa快速检测的方法，具体包括以下处理步骤：
[0026] 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，猕猴桃花粉Psa的富集培养，提取花粉混合菌 悬液的DNA，用巢氏PCR扩增，PCR产物电泳，外引物扩增出现590bp条带、内引物扩增出现 240bp条带为阳性。
[0027]进一步，具体包括以下处理步骤：
[0028] a)根据陕西猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物；
[0029] b)猕猴桃花粉Psa的培养富集；
[0030] c)花粉菌悬液中Psa DNA的提取；
[0031] d)巢氏PCR扩增；
[0032] e)PCR产物电泳检测。
[0033]以下通过具体实施例和对比例对本
【发明内容】
和效果进行说明。
[0034] 实施例一
[0035]猕猴桃Psa巢氏PCR检测方法建立
[0036] (1)称猴桃Psa及Pseudomonas syringae pv · tomato、Pseudomonas syringae pv · Theae、Pseudomonas avellanae培养:称猴桃Psa用King' B液体培养基培养，
[0037] (2)病原菌DNA提取:采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取目的DNA。
[0038] (3)引物设计:根据陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因设计两对引物， 外、内引物扩增参考序列分别为590bp、240bp。
[0039] 猕猴桃花粉Psa的培养富集方法为:称取猕猴桃花粉0.01g，加入装有15mL已高压 灭菌并冷却的金氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24°C、180r/ min培养12h后，4°C保存待用。
[0040] 提取花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取lmL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中， 室温，11，OOOrprn离心lmin，弃上清液，收集菌体;将收集的菌体加入lmL灭菌ddH2〇反复吸 打，洗涤菌体，11，OOOrprn离心lmin，弃上清液，重复洗涤一次，取100yL灭菌ddH2〇，反复吸 打，溶解沉淀，于100 °C水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8，OOOrpm离心lmin，取上 清液，-20 °C保存备用。
[0041] (4)扩增体系：总体积25yL，其中2XPCR Master 12.5yL，上游引物（10μπιο1/1)1μ L，下游引物（10ymol/L)lyL;DNA模板lyL;Sterilized ddH20 9.5yL;其中外引物扩增所用 DNA模板为花粉菌悬液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50 倍。
[0042] (5)巢氏 PCR 扩增程序为：94Γ、5π?η，（94Γ、1〇8θ(：，55Γ、3〇8θ(3,72Γ、1π?η)35Α 循环。72°(：、〇11^11，4°(：保温。
[0043] (6)电泳检测:PCR反应结束后，取5yL PCR产物点样于1 %琼脂糖凝胶中Du-Red核 酸染料染色。电泳选用1XTAE缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min。电泳结束后 在凝胶成像系统上检测并拍照。
[0044] (7)PCR产物测序:PCR阳性扩增产物，送至上海生物工程有限公司进行测序，样品 均采用双向测序以减少误差。将测序结果用DNAMAN生物软件对序列进行校正，并在NCBI数 据库(http: //www. nebi . nlm. nih. gov/)中通过BLAST工具检索同源性。
[0045] 结果见图1、表1。图1中：泳道1、2、3、4为外引物扩增Psa、Pseudomonas syringae pv. tomato、Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外 引物扩增为阳性；泳道6、7、8、9为内引物扩增Psa、Pseudomonas syringae pv· tomato、 Pseudomonas syringae pv.Theae、Pseudomonas avellanae hrpW结果，Psa外引物扩增为 阳性。由图1可知，猕猴桃Psa DNA巢氏PCR扩增，可以扩增出590bp、240bp条带，与预期条带 大小一致，而Pseudomonas syringae pv · tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、 Pseudomonas avellanae DNA进行巢氏PCR，不能扩增条带。进一步将猕猴桃Psa DNA外引物 扩增PCR产物测序结果在NCBI中通过BLAST工具检索同源性，结果如表1，表明陕西猕猴桃 Psa hrpW与数据库中猕猴桃Psa hrpW同源性为99%，而与Pseudomonas syringae pv. tomato、Pseudomonas syringae pv· theae、Pseudomonas avellanae同源性在90% 以 下，因此所建立的方法可检测陕西猕猴桃Psa，并可以区分Pseudomonas syringae pv.tomato、Pseudomonas syringae pv.theae、Pseudomonas avellanae。
[0046] 表1扩增产物序列与目标序列同源性
[0047]
[0048] 注：CP011972·1、ΗΕ793307·1、FR734164·1、AF232004·3、FR734165·1、AJ842305·1 为661^&1^中？8&1〇10318884株、？8&0103-80 4252.八，1株、？8&15?8.57株、卩8611(1〇111〇的8 syringae pv.tomatoDC3000株及Pseudomonas syringae pv.theaeCFBP 4097株、 Pseudomonas avellanae hrpW基因序列号。
[0049] 实施例二
[0050] 猕猴桃Psa PCR检测的灵敏度
[0051 ] 挑取Psa单菌落于100mL无菌King's B液体培养基中，牛皮纸封口，24°C，200r/min 培养16h，获得菌悬液。用血细胞计数板测定菌悬液浓度，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度 梯度分别为 107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、10 4cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL， 分别提取DNA，进行PCR扩增，研究菌悬液中Psa的检测限，确定该方法检测灵敏度。
[0052] 由图2可知：泳道1-7:检测菌悬液浓度依次为107cfu/mL、10 6cfu/mL、105cfu/mL、 104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL、10cfu/mL，目的条带随着Psa菌悬液浓度的降低，依次变 暗，当浓度降低为103cfu/mL时，条带微弱，依然能检测到Psa，但当浓度为102cfu/mL、 lOVfu/mL时没有条带，说明浓度低于103cfu/mL的菌悬液检测不到目的条带。因此，本试验 中Psa的检出限为10 3cfu/mL，灵敏度较高。
[0053] 实施例三
[0054] 猕猴桃花粉Psa PCR检测
[0055] (1)猕猴桃花粉Psa的培养:分别取已制备好的猕猴桃花粉0.01g，对应加入编号1- 23含有15mL已高压灭菌并冷却的King'B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口。于恒温震荡 培养箱中24°C，180r/min培养12h后，获得混合菌悬液。4°C保存待用（只可短时保存）。
[0056] (2)菌悬液中Psa DNA的提取:取lmL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温11， OOOrpm离心lmin，弃上清液，收集菌体。加入lmLddH2〇反复吸打，洗涤菌体，11，OOOrpm离心 lmin，弃上清液。重复洗涤一次。取100yLddH20，反复吸打，溶解沉淀，于100 °C水浴15min，水 浴后立即置于冰上冷却3min，8，OOOrpm离心lmin，取上清液，-20 °C保存备用。
[0057]引物设计、PCR扩增体系、扩增条件、电泳检测同实施例一(4)、（5)、（6)。扩增结果 如图3、图4,图3中泳道1、12:阳性对照;泳道2、11:阴性对照;泳道3-6为花粉样品8、9、20、22 外引物扩增结果;泳道7-10为花粉样品8、9、20、22内引物扩增结果。图4中泳道1为阳性对照 组，泳道2-24为猕猴桃花粉样品(对应花粉编号为1 -23 )，其中泳道9、10、21、23的Psa检测为 阳性(对应花粉编号8、9、20、22 )，其余均为阴性。
[0058]图3和图4,23个花粉样品中有4个样品扩增得到550bp左右的外引物扩增条带和 240bp左右的内引物扩增条带，分别与预期扩增片段及阳性对照组扩增片段大小一致，可确 定8、9、20、22号花粉样品中均含有Psa。
【主权项】
1. 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于包括以下处理步骤： a) 根据猕猴桃优势Psa靶基因设计巢氏PCR引物； b) 进行猕猴桃花粉Psa的培养富集； c) 提取花粉菌悬液中Psa的DNA; d) 进行巢氏PCR扩增； e) 对PCR产物进行电泳检测。2. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述步骤a)巢氏PCR 弓丨物是根据猕猴桃溃疡病优势病原菌Psa的hrpw基因的保守序列设计的，外引物、内引物的 扩增长度分别为590、240bp。3. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述步骤b)猕猴桃 花粉Psa的培养富集方法为:称取猕猴桃花粉O.Olg，加入装有15mL已高压灭菌并冷却的金 氏B液体培养基的玻璃试管中，棉塞封口，于恒温震荡培养箱中24°C、180r/min培养12h后，4 °C保存待用。4. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述的步骤c)提取 花粉菌悬液中Psa的DNA方法为：取lmL过夜培养的菌悬液于1.5mL离心管中，室温，11， OOOrpm离心lmin，弃上清液，收集菌体;将收集的菌体加入lmL灭菌ddH20反复吸打，洗涤菌 体，11，OOOrpm离心lmin，弃上清液，重复洗涤一次，取100yL灭菌ddH2〇，反复吸打，溶解沉 淀，于l〇〇°C水浴15min，水浴后立即置于冰上冷却3min，8,000rpm离心lmin，取上清液，-20 °C保存备用。5. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述的步骤d)巢氏 PCR扩增体系为：总体积25yL，其中2 X PCR Master 12.5yL，1 Ομπιο 1 /L的上游引物1 yL，10μ mo 1 /L的下游引物lyL;DNA模板lyL; ddH20 9.5yL;其中外引物扩增所用DNA模板为花粉菌悬 液中Psa DNA，内引物扩增所用DNA模板为外引物扩增的PCR产物稀释50倍。6. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述的步骤d)巢氏 PCR扩增程序为:首先94°C变性5min;其次进行35个循环反应，包括94°C变性10sec，55°C退 火 30sec，72°C 延伸 lmin;最后 72°C 延伸 10min，4°C 保温。7. 如权利要求1所述的猕猴桃花粉中Psa的检测方法，其特征在于:所述的步骤e)PCR产 物电泳检测方法为：P C R反应结束后，取5 μ L P C R产物点样于1 %的琼脂糖凝胶中，选用 2000bp DNA Marker;电泳选用1 X ΤΑΕ缓冲液，条件为：电压100V，电流60mA，电泳25min，电 泳结束后在凝胶成像系统上检测并拍照。
【文档编号】C12Q1/68GK105936936SQ201610464826
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】高贵田, 曹凡, 杜莹琳, 朱丹
【申请人】陕西师范大学