一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物技术，特别涉及一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸 的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体（Mycoplasmalpneumonia，MP)是一种介于病毒和细菌之间的微生物， 是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎约占各种肺炎的10%，已成为发病率较高的传播 疾病，严重的支原体肺炎也可导致死亡。
[0003]MP感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为MP分离培养，血清学检查和PCR诊断。MP分离培养是最传统的检测，该方法虽然可靠，但要求苛刻，敏感性低，耗时也很长 (2到3周)，因此使该方法无法在临床上得到有效应用。血清学检测主要包括补体结合试 验、ELISA、冷凝集试验以及间接血凝试验。血清学检测方法特异性和灵敏度适中，简便快 捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。PCR的方法可 直接检测MP的核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原 体检出率方面具有相当的优势，是MP病原体检测的主要方法之一。但是PCR的方法对硬件 设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏 远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的MP病原体诊 断方法。
[0004]与PCR不同的是近年来陆续出现的恒温扩增技术。这些扩增技术应用不同的原理 和方法，可在某一特定温度条件下，实现核酸（DNA或RNA)的扩增。国际上已有的恒温扩增 技术如下： 链置换扩增术（SDA)、核酸序列扩增术（NASBA)、转录酶扩增术（TMA)、滚环扩增术 (RCA)、圆环恒温扩增术（LAMP)、解链酶扩增术（HAD)。
[0005]恒温扩增技术对所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的 实际应用价值。
[0006]无论是PCR或恒温扩增技术，其扩增产物均为核酸。这些核酸产物均需以一定的 技术手段予以检测。如实时荧光定量PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信 号的激光扫描从而实时检测核酸产物量，但标记探针的荧光染料和荧光PCR仪较昂贵。琼 脂糖凝胶电泳是通过对核酸产物分离后染色，从而直观地看到扩增产物。但该方法只能判 断扩增物的大小，其特异性不高。
[0007]免疫胶体金技术是上世纪80年代继荧光素、放射性同位素和酶三大标记技术后 发展起来的固相标记免疫测定技术。该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当 这些标记物在相应的配体处大量聚集时，形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而用于定 性或半定量的快速免疫检测方法中。快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体 技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近 年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术在检测时，由于 层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，形成抗原-抗体-金标颗粒复合物而富集在 包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为 阳性，只有一条红线时，判为阴性。胶体金颗粒本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了 酶标致癌性底物显色及终止显色的步骤，对人体无毒害；免疫胶体金层析技术快速简便、准 确，结果直观、而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时 也减小了因操作引起的误差。
[0008] 但以免疫反应为基础的检测试剂有不足之处，真正阻碍这种蛋白质薄膜层析诊断 技术发展的不是技术与设备，而是特异性单克隆抗体的制备。单克隆抗体的制备复杂费时， 使得蛋白质层析诊断的产品研制周期长，不能很快形成系列产品，难以形成有效的覆盖面。 而且检验的灵敏度和特异性有时还不够理想。另外，从感染到抗体产生还存在窗口期问题。
[0009] 1996年，美国西北大学Mirkin研究组利用纳米金与疏基之间能够形成稳定的 Au-S键的性质制备了纳米金-DNA复合纳米探针，可用于检测DNA。纳米金与疏基形成的 Au-S键是牢固的共价键。近年来，免疫组织化学中的常用方法-胶体金标记/银染信号 放大法因其价格低廉、灵敏度高、操作简单在核酸标记方面已被证明具有较高的实用价值， 胶体金在DNA芯片的检测已有相关报道。通常是将目标分子标记上巯基，因胶体金颗粒 的表面包围着一层结合力比较弱的带电配体如柠檬酸，这些配体分子很容易被结合力强 的巯基基团所取代，因而可以将胶体金连接上目标核酸，然后将标记的目标分子与芯片 上的探针杂交实现对其的检测。但这种方法操作繁琐，且每次杂交均需标记特异的靶标分 子，不具备通用性。
【发明内容】
[0010] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种肺炎支原体的胶体金标检测试剂 盒，包括： (1) 胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤 维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线(检测线)和C线(质控线)，通用探针1的5'端巯基化修饰 后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交，将标记胶体金后的通用探针1 固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；所述检测线处包被链霉亲和素，质控线包被抗地高辛抗 体； (2) 、分别盛有通用探针2、特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：所述通用探针 2标记有生物素，且和特异探针B系列互补配对杂交，特异探针A系列标记有地高辛，其一 端和肺炎支原体特异扩增产物杂交，另一端和通用探针1杂交，特异探针B系列一端和肺炎 支原体特异扩增产物杂交，另一端和通用探针2杂交；特异探针A系列可以有多种，如A1、 A2……，分别和支原体特异扩增产物的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异 探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和支原体特异扩增产物的不同区域互补配对杂 交，分别装在不同的探针管里； (3) 、盛装着对肺炎支原体的16srRNA-段保守序列特异性的引物的引物管； (4) 、盛装着三种酶混合物的管：逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7RNA聚合酶和RnaseH; 所述通用探针1序列为SeqNo. 1 ; 所述特异探针A系列的序列分别为SeqNo. 2、SeqNo. 3 ; 所述特异探针B系列的序列分别为SeqNo. 4、SeqNo. 5 ; 所述通用探针2序列为SeqNo. 6 ; 所述通用探针1序列为： 5 ' -SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3 ' (SeqNo. 1) 所述特异探针Al、A2 (两条）序列为： 5'-Dig-GGTTCGCCTCGAAGAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3' （SeqNo.2) 5' -Dig-CCCTCGACCAAGCCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3'（SeqNo.3) 所述特异探针B1、B2 (两条）为： 5'-CCTCCAGCTCTGAACGTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3' （SeqNo.4) 5'-GGGGCGGGGTGAAGGATTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3'（SeqNo.5) 所述通用探针2序列为： 5' -Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCC-3'（SeqNo.6) 所述引物具有如下序列： R引物：5' -TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCGTGAACTTGGTGTGGITT-3' (SeqNo. 7) F引物：5' -GGCAGTCAGACGATGATTACAGG