检测属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物的方法

专利名称：检测属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物的方法
技术领域：
本发明涉及以对于微生物的检测具有特异性的分子作为指标的、该微生物的检测方法，以及该微生物的检测用试剂盒，所述微生物属于作为一般的肺炎的原因微生物的肺炎支原体pneumoniae)取 / 或生殖支原体genitalium)。
背景技术：
( I)肺炎支原体肺炎的患者比例和症状
肺炎支原体感染病归类为社区获得性非典型肺炎，其在社区获得性肺炎中所占比例是成人30 40%，限于15 25岁的年轻成人则波及60 70%。肺炎支原体的感染途径是经呼吸道感染，在学校等机构、家族内感染扩大的情况也不少。另外，在肺炎支原体感染病中，肺炎发生为感染病的约3 5%，其余成为支气管炎、上呼吸道炎、隐性感染。特征性症状是从感染初期起不伴咳痰的顽固性咳嗽，有时也伴有发热、头痛、咽痛、恶寒、全身倦怠等症状。( 2)肺炎支原体感染病的检查现状
肺炎支原体感染病的检查一般为来自患者咽拭子的培养检查、应用患者血清的抗体检查。对于培养检查，肺炎支原体自身仅在特殊的培养基中发育、操作困难、在最终肺炎支原体的鉴定中需要实施PCR检查，因此目前的情况是只能在限定的设施中检查，另外，由于培养需要数周，因此需要迅速得到结果的检查。另一方面，抗体检查与一般的培养检查相比操作容易且迅速得到结果，因此是常常应用的检查，但由于支原体的IgM抗体效价具有持续性，成问题的是，难以判断是以前的感染还是本次的感染、至抗体效价升高花费时间。为了解决这些问题，提议根据感染急性期和恢复期的随时间的抗体效价升高进行判断，但是，至恢复期进行抗体检查非常花费时间，因此治疗延迟，对患者造成症状的拖延、恶化，并且进一步地，可能产生继发感染引起的感染扩大的不利影响。另外，为了解决上述问题，公开了用于诊断肺炎支原体感染病的、特异性地检测属于肺炎支原体的微生物的有用抗体，以及检测方法。例如，专利文献I记载了应用针对约43千道尔顿(KDa)的肺炎支原体的膜抗原蛋白质的单克隆抗体的免疫检测法。另外，专利文献2记载了应用针对核糖体蛋白质L7/L12的抗体，可以准确性良好地进行肺炎支原体的检测。另外，专利文献3记载了通过针对肺炎支原体的Pl蛋白质的单克隆抗体(其仅显示与支原体属的其它种或共存菌群的其它病原种1%或更低的交差反应性)，可以进行肺炎支原体感染的迅速且特异的诊断。但是，对于上述抗体以及应用该抗体的检测法，为了检测临床样本中属于肺炎支原体的微生物，有时也需要对含有该微生物的样本进行复杂的预处理，另外，具有对于特异性、灵敏度低的肺炎支原体的特异性诊断不充分的问题。(3)生殖支原体和疾病
非淋菌性尿道炎的主要病因菌已知沙眼衣原体{Chlamydia trachoimtiS、。在非淋菌性尿道炎患者中，检测出沙眼衣原体的为30 40%左右，多数其症状的来源不明。除了沙眼衣原体，关注支原体属以及脲原体属的微生物，特别地，生殖支原体显示为非淋菌性尿道炎以及性行为感染病的病因菌中的一种。(4)生殖支原体感染病的检查现状
对于生殖支原体感染病，论文中有利用培养法、PCR法的报告实例，但由于这些方法不能进行迅速的诊断，需要迅速且特异性地检测临床样本中属于生殖支原体的微生物的方法。现有技术文献
专利文献 专利文献I :日本特开昭63-298号公报 专利文献2 :国际公开W02001/057199号小册子 专利文献3 :日本特开平5-304990号公报。

发明内容
根据以前的方法，不能迅速且特异性地检测属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物。因此目前的情况是，无法迅速地诊断肺炎支原体和/或生殖支原体感染病，治疗延迟，对患者造成症状的拖延、恶化，并且进一步地，可能产生继发感染引起的感染扩大的不利影响。如果能够迅速地检测、诊断对这些支原体的感染，则施用对支原体有效的大环内酯类抗生素成为可能，可以在感染初期开始准确的治疗。另一方面，已知肺炎支原体和生殖支原体在血清学上非常相近，但如上述，由于肺炎支原体和生殖支原体的感染部位(组织、器官等)不同，认为如果可以鉴定可特异性地检测两种微生物的分子，则可以以该分子为指标诊断两种感染病。本发明鉴于上述问题作出，其目的是提供鉴定用于迅速且特异性地诊断肺炎支原体和/或生殖支原体感染病的分子、并以该分子为指标的检测方法，以及检测试剂盒。本发明者反复深入研究了上述现状，结果发现，为了迅速且特异性地检测肺炎支原体和/或生殖支原体感染，以属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物所具有的DnaK为指标。DnaK蛋白质也称为热休克蛋白70 (Hsp70)，其作为细胞暴露于热等应激条件下时表达量升高而保护细胞的一群蛋白质而发现，目前已知与翻译蛋白质的细胞内输送、重折叠(分子伴侣功能)有关。在免疫学测定法中，以DnaK蛋白质为指标的优点是(I)DnaK蛋白质是与蛋白质的输送、重折叠有关的蛋白，因此是平素表达的蛋白质，⑵总蛋白质中的1%左右是DnaK，(3)存在形式不是单聚体，存在3聚体、6聚体、其以上的多聚体。本发明根据这些知识而完成。即，根据本发明，提供了以下事项。[I]肺炎支原体或生殖支原体的检测方法，其特征是，以肺炎支原体或生殖支原体的DnaK为指标。[2] [I]的方法，其中对DnaK蛋白质进行免疫学分析。[3]对肺炎支原体或生殖支原体具有特异性的抗DnaK抗体。[4]肺炎支原体或生殖支原体的检测用试剂盒，其含有[3]的抗DnaK抗体。[5] [I]的方法，其以DnaK基因为指标。
[6]对肺炎支原体或生殖支原体具有特异性的引物或探针。[7]肺炎支原体或生殖支原体的检测用试剂盒，其含有[6]的引物或探针。本发明中“该微生物”意味着肺炎支原体或生殖支原体，特别是指具有病原性、作为下述疾病的原因菌诊断意义高的微生物。本发明中，“与该微生物特异性地反应的抗体”指与该微生物的种或属特异性地反应的抗体，在微生物感染病的诊断中与该微生物的种特异性地反应的抗体是特别有用的。根据以本发明中的特定分子为指标检测属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物的方法，可以迅速且特异性地诊断该微生物引起的肺炎支原体和/或生殖支原体感染 病。


[图I]是显示比较肺炎支原体M129株(Pl基因型I型)和株(Pl基因型11型)中的DnaK基因(序列号6)的碱基序列(第I 720号)的结果的说明图。[图2]是在图I之后、显示比较肺炎支原体两株中的DnaK基因的碱基序列(第721 1440号)的结果的说明图。[图3]是在图I以及图2之后、显示比较肺炎支原体两株中的DnaK基因的碱基序列(第1441 1788号)的结果的说明图。[图4]是显示比较肺炎支原体M129株(Pl基因型I型)和株(Pl基因型11型)中的Pl基因(M129株序列号7、株序列号8)的碱基序列(关于M129株的第I 717号)的结果的说明图。[图5]是在图4之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于M129株的第718 1416号)的结果的说明图。[图6]是在图4以及图5之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于M129株的第1417 2136号)的结果的说明图。[图7]是在图4 图6之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于M129株的第2137 2856号)的结果的说明图。[图8]是在图4 图7之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于Ml29株的第2857 3564号)的结果的说明图。[图9]是在图4 图8之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于M129株的第3565 4284号)的结果的说明图。[图10]是在图4 图9之后、显示比较肺炎支原体两株中的Pl基因的碱基序列(关于M129株的第4285 4884号)的结果的说明图。
具体实施方案以下对本发明进行更详细地说明，以下组成要素的说明是本发明实施方案的代表例，本发明不仅特定于这些内容。本发明的肺炎支原体或生殖支原体的检测方法的特征是，以该微生物的DnaK为指标，检测肺炎支原体和/或生殖支原体(即，肺炎支原体或生殖支原体中的任一种，或肺炎支原体以及生殖支原体两种，特别优选肺炎支原体以及生殖支原体两种)，通过检测这些微生物，可以诊断肺炎支原体感染病和/或生殖支原体感染病。根据本发明诊断的肺炎支原体感染病是支原体肺炎。另外，生殖支原体感染病是非淋菌性非衣原体尿道炎、宫颈炎。诊断肺炎支原体感 染病时，可以使用可能存在肺炎支原体的样本，例如可列举咽拭子、鼻腔拭子、鼻腔吸引液、鼻涕、喀痰、肺泡洗涤液。诊断生殖支原体感染病时，可以使用可能存在生殖支原体的样本，例如可列举尿、尿道/宫颈擦拭物。上述两种感染病是哪一种的识别可根据作为测定对象的样本的采取部位决定。本发明中作为指标的DnaK例如肺炎支原体来源的DnaK蛋白质(NCBI号NP_110122)、DnaK 基因(NCBI 号NC_000912 REGION: 521837. . 523624)或生殖支原体来源的 DnaK 蛋白质(NCBI 号AAC71527)、DnaK 基因(NCBI 号L43967 REGION:374919. . 376706)。上述列举的蛋白质或基因是属于该微生物的一个菌株的例子，本发明中作为对象的该微生物所具有的DnaK序列显示为与上述DnaK蛋白质或基因相应的序列。另外，如实施例8所示的肺炎支原体的DnaK基因在肺炎支原体的Pl基因型不同的株间也是100%—致的，另外，其在不同分离时和过去50年间也未见变异。由此认为，肺炎支原体的DnaK基因以及DnaK蛋白质的序列是稳定的。由此，优选参考前述NCBI中公开的基因序列或蛋白质序列。I.应用抗体的该微生物的检测方法以及试剂盒
检测本发明的肺炎支原体或生殖支原体的方法的第一方案的特征是，应用对该微生物具有特异性的抗DnaK抗体。另外，选择特异性抗体时，对该微生物的灵敏度是至少IO5CFU/mL以上、优选104CFU/mL以上、更优选103CFU/mL以上，对对象以外的微生物的灵敏度是至少107CFU/mL以下、优选108CFU/mL以下。本发明中可用的抗体可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种，其可以通过以下方法或其它类似的方法取得，但不限于这些方法。该抗体的制备方法的第一方案可以应用上述DnaK蛋白质的全长或其部分肽进行制备。对于该DnaK蛋白质的基因序列以及氨基酸序列已知的微生物，可以对与其它微生物中该蛋白质的氨基酸序列相似性少的区域合成肽片段。用于制备抗体的肽长度没有特别限定，在针对该DnaK蛋白质的抗体的情况下，具有表征该蛋白质的长度即可，优选应用5个氨基酸以上、特别优选8个氨基酸以上的肽即可。将该肽或全长蛋白质原样地或与KLH(匙孔血蓝蛋白)、BSA (牛血清白蛋白)等载体蛋白交联后，按需要与佐剂共同接种动物，通过回收其血清可获得包含识别该DnaK蛋白质的抗体(多克隆抗体)的抗血清。另外，也可以从抗血清纯化抗体而使用。接种动物是绵羊、马、山羊、兔、小鼠、大鼠等，特别地，在多克隆抗体制备中优选兔、山羊等。另外，也可以通过制备杂交瘤细胞的公知方法获得单克隆抗体，这种情况下优选小鼠。另外，可以将该蛋白质的全长或5个残基以上、期望地8个残基以上的氨基酸序列作为与谷胱甘肽S-转移酶等的融合蛋白质纯化、或未纯化地原样用作抗原。也可以这样制备，通过书籍(Antibodies; A laboratory manual, E. Harlow 等，Cold Spring HarborLaboratory Press)中示出的各种方法以及基因克隆法等，应用分离的免疫球蛋白基因，在培养的细胞中表达基因重组抗体。进一步地，通过根据公知的手法从如上述制备的抗体选择与肺炎支原体和/或生殖支原体(即，肺炎支原体或生殖支原体中的任一种，或肺炎支原体以及生殖支原体两种，特别优选肺炎支原体以及生殖支原体两种)特异性地反应、与其以外的病原菌不反应的抗体，可以制备特异性高的该抗体。除前述的方法以外，对于可以作为本发明的标记抗原应用的该DnaK的抗体也可以通过以下方法或其它类似的方法取得，但不限于这些方法。a)对于该DnaK蛋白质的基因序列以及氨基酸序列已知的微生物，对与其它微生物中的该蛋白质的氨基酸序列相似性少的区域合成肽片段，将其作为免疫原制备多克隆抗体或单克隆抗体，从而可以获得目的抗体。另外，通过通常的基因操作手法，可以获得该基因的全长序列，所述手法为应用以已知的该基因的两端部位中的DNA序列作为引物的PCR法的基因扩增、将相同部分序列作为模板探针的杂交法等。 其后，构建与其它蛋白质基因的融合基因等，以大肠杆菌等作为宿主利用公知的基因导入手法在宿主内插入该融合基因，大量表达后，对用作融合蛋白质的蛋白质通过抗体亲和柱法等纯化表达蛋白质，从而可以获得目的蛋白质抗原。该情况下，由于该DnaK蛋白质的全长蛋白质成为抗原，取得对于在对象以外的微生物间保守的氨基酸部分的抗体也不合乎本发明的目的。因此，对于根据本方法获得的抗原，通过公知的手法取得产生单克隆抗体的杂交瘤，选择产生仅与该微生物反应的抗体的克隆，从而可以取得目的抗体。b)对于该DnaK蛋白质的氨基酸序列未知的微生物，一个方法是，由于该DnaK蛋白质的氨基酸序列在菌种间80 100%、优选90 100%相同，基于其氨基酸序列的相同部分的序列通过PCR法进行特定序列部分的基因扩增，通过应用以相同部分序列作为模板探针的杂交法等通常的基因操作手法，可以容易地取得该蛋白质基因。对于目的蛋白质抗原的取得，构建该蛋白质基因与其它蛋白质基因的融合基因等，以大肠杆菌等为宿主通过公知的基因导入手法向宿主内插入该融合基因并使其大量表达。其后，通过对用作融合蛋白质的蛋白质的抗体亲和柱法等，可以取得表达蛋白质。该情况下，由于该DnaK蛋白质的全长蛋白质成为抗原，取得对于在对象以外的微生物间保守的氨基酸部分的抗体也不合乎本发明的目的。因此，对于根据本方法获得的抗原，通过公知的手法取得产生单克隆抗体的杂交瘤，选择产生仅与该微生物反应的抗体的克隆，从而可以取得目的抗体。c)或者，作为该DnaK蛋白质的氨基酸序列未知情况下的其它方法，制备与已知的该DnaK蛋白质的氨基酸序列中在该微生物间保守的共有序列部分相当的5 30个氨基酸的合成肽，针对其肽序列，用公知的方法制备多克隆抗体或单克隆抗体。通过应用该抗体的亲和柱胶体金层析(chromato)纯化目的微生物细胞裂解液,可以获得高度纯化的该DnaK蛋白质。对于蛋白质的纯化度不足的情况，应用作为公知纯化手法的离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤等手法，可以提高纯化度。基于得到的纯化DnaK蛋白质抗原，通过公知的方法取得杂交瘤，选择与目的微生物特异性地反应的杂交瘤，从而可以取得目的抗体。作为该抗体的制备方法的第二方案，如实施例I所示地，以肺炎支原体作为免疫原，可以制备与该DnaK蛋白质反应的对肺炎支原体和/或生殖支原体具有特异性的抗体。另外，同样地，也可以以生殖支原体作为免疫原进行制备。以上述微生物作为免疫原的情况下，免疫原的配制可以利用公知的方法进行。公知的方法可举出超声波处理、热处理、表面活性剂处理、福尔马林处理、冷冻融解处理、盐酸处理。对于通过上述的方法得到的对于该微生物具有特异性的本发明的抗体，通过将其应用于各种免疫学分析法，可以提供对该目的微生物特异的各种检测试剂以及试剂盒。该抗体可以在公知的全部免疫学分析法中利用。例如，其可以在下列方法中利用使该抗体在聚苯乙烯乳胶粒子上吸附的凝集反应法，在微量滴定板中进行的ELISA法，免疫胶体金层析(immunochromato)法,将用着色粒子或具有显色能的粒子、磁粒子、酶或突光体标记的该抗体单独或以多个组合的夹心法等。另外，在本发明的以DnaK为指标的检测方法中，可以不活跃破坏细胞而特异性地检测肺炎支原体和/或生殖支原体，进一步，为了高灵敏度地测定，可以使用公知的微生物的处理方法。具体地，应用下列方法应用以TritonX-100、Tween-20、SDS为首的各种表面活性剂的提取试剂的处理法，应用适当的蛋白酶等酶的酶处理法，以通过物理方法破碎微 生物细胞为首的已知的细胞结构破碎方法。期望的是，根据表面活性剂等的组合，对每个微生物根据试剂设定最适的提取条件。另外，在本发明中，应用抗体的该微生物检测用试剂盒与应用该检测方法的检测用试剂盒相当。可以含有至少I种本发明的抗体，适应于使用的免疫测定法，可以适当变更使用的抗体的数目、种类、组合。进一步地，作为样本的预处理，也可以包含利用上述提取法的预处理液。2.应用基因的该微生物的检测方法以及试剂盒
DNA的提取方法可以适用公知的方法。例如，可列举对样本通过表面活性剂进行可溶化、进行通过除蛋白剂除蛋白等操作而获得DNA的方法等。优选地，如果后述的该DnaK基因的解析是可能的，例如，在随后通过PCR法进行基因扩增的情况下，优选在不含PCR反应的阻害物质的状态下配制。样本的预处理方法也可以使用应用上述抗体的该微生物的检测方法和同样的方法。DNA提取量为，提取使随后进行的该DnaK基因的解析成为可能的量即可。在用于PCR法的情况下，例如，每个反应为5 50fg以上。应用提取的DNA进行该DnaK基因的解析。该DnaK基因的解析根据公知的方法进行。例如，有利用PCR法检测该DnaK基因的扩增的方法、利用探针法鉴定该DnaK基因的方法。例如，利用PCR法的该DnaK基因的扩增可以是任何方法，只要可以扩增目的碱基序列即可，利用探针法的该DnaK基因的鉴定可以是任何方法，只要可以鉴定目的碱基序列即可。为了进行该DnaK基因的目的碱基序列的扩增或鉴定，可以适宜选择并应用与肺炎支原体和/或生殖支原体显示80 100%同源性、与其以外的病原微生物显示优选60%以下的同源性的序列。另外，这些引物、探针只要能扩增目的DNA片段即可，也可以在上述的碱基序列中存在变异、缺失、添加。例如，扩增肺炎支原体的DnaK基因时，如后述的实施例中那样的，可以基于NCBI中公开的肺炎支原体的DnaK基因序列(NCBI编号NC_000912 REGION: 521837. . 523624)设计PCR扩增引物。具体地，为了扩增前述DnaK基因的全长，可以使用有义引物MpDnaK —S以及反义引物MpDnaK—A。
另一方面，扩增生殖支原体DnaK基因时，可以基于NCBI中公开的生殖支原体的DnaK 基因序列(NCBI 编号L43967 REGION: 374919. 376706)设计 PCR 扩增引物。另外，如实施例8所示地，肺炎支原体的DnaK基因在肺炎支原体的Pl基因型不同的株间也是100%—致的，另外，在不同分离时和过去50年间也未见到变异。据此，对于特异性地检测肺炎支原体的DnaK基因，不必考虑肺炎支原体的株间的差异，通过考虑与其它菌株的差异就能够进行设计。另外，肺炎支原体的DnaK蛋白质的序列也考虑为稳定的，因此，认为应用其制备的抗体没有由基因型、地域、年代引起的反应性差异，可以在广泛的地域、年代中使用。应用本发明的基因的该微生物检测用试剂盒相当于应用该检测方法的检测用试剂盒。其为用于在肺炎支原体和/或生殖支原体的特异性的检测方法中应用的试剂盒，其特征在于至少包含用于扩增对该目的DnaK基因特异的碱基序列的2种引物。 另外，作为其它的方案，其特征在于至少包含用于鉴定对该目的DnaK基因特异的喊基序列的I种探针。进一步地，作为样本的预处理，也可以包含利用上述提取法的预处理液。
实施例以下通过实施例对本发明进行具体地说明，但它们不限定本发明的范围。实施例I :肺炎支原体以及生殖支原体特异性的抗原的鉴定，以及该特异性抗体的制备
(I)对肺炎支原体以及生殖支原体具有特异性的单克隆抗体的制备 (1-1)免疫菌株的培养以及免疫抗原的配制
将肺炎支原体6株(冊Bru Mac M52 PI1428 M129-B7株从ATCC购买)的各株分别接种到PPLO葡萄糖肉汤(含有马血清、新鲜酵母提取物、醋酸亚铊)中，在37°C在需氧条件下培养7天。将离心回收的各菌体洗涤后，在PBS中悬浮并冻融处理，将得到的物质作为免疫抗原。(1-2)免疫
在免疫致敏中，使用6周龄的雌性Balb/c小鼠(日本々>7社)。将来自各菌体的抗原溶液分别用弗氏完全佐剂(SIGMA社)乳化，将抗原IOOii g在小鼠中皮下注射。其后，在2周间将用弗氏不完全佐剂(SIGMA社)乳化的抗原50 u g皮下注射，直至见到对免疫原的抗体效价升高。进一步地，在细胞融合3日前，将用PBS稀释的抗原25iig注射在腹腔内。(1-3)杂交瘤制备
根据常规方法，进行以下的操作。将从免疫致敏小鼠无菌取出的脾脏细胞和骨髓瘤细胞(P3U1)用聚乙二醇1500 (Roche社)融合，种植在96孔平板中。应用HAT培养基选择培养杂交瘤细胞，对于这些培养上清，在以下的ELISA条件下实施筛选。在ELISA的固相化中，使用衍生自作为免疫原的6种的各株的各肺炎支原体抗原I U g/mL。封闭处理后，添加培养上清，使其在4°C反应过夜。用洗涤液洗涤3次后，添加2000倍稀释的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体(Dako社)，在室温反应I小时。用洗涤液洗涤3次后，添加基质(TMBZ)溶液，在室温反应10分钟。反应停止后，测定450nm的吸光度。对由此选出的杂交瘤通过限度稀释法实施克隆，建立克隆株。对从其中16株产生的单克隆抗体进行以下的研究。得到的克隆株与来自6种各株的免疫抗原中的任一都有反应。( 1-4)单克隆抗体的识别蛋白质的分子量的确认
通过蛋白质印迹，确认了上述16种单克隆抗体的识别蛋白质的分子量。对肺炎支原体抗原(ra株)10 i! g进行SDS-PAGE，接着在硝酸纤维素膜上印迹。将各克隆的培养上清添加在膜上，在室温反应I小时。用洗涤液洗涤3次后，添加1000倍稀释的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体，在室温反应I小时。用洗涤液洗涤3次后，添加基质(4-氯-I-萘酚)溶液，并在室温反应10分钟。显色后，用蒸馏水洗涤并停止反应。
其结果证明，10种识别62 69KDa的分子，6种识别40 45KDa的分子。由此，对取得数多的认为抗原性高的62 69KDa的分子，接着尝试抗原的鉴定。(1-5)取得抗体的亚类的鉴定
应用Iso Strip (Roche社)确认识别62 69KDa的分子的单克隆抗体10种的亚类时，证明6种是H链G1/L链K，I种是H链G1/L链入，I种是H链2b/L链k，I种是H链2b/L链入，I种是H链2a/L链入。(2)肺炎支原体以及生殖支原体特异性的抗原的鉴定 (2-1)单克隆抗体识别抗原的纯化
(2-1-1)菌体培养
在抗原纯化中，应用迄今全基因序列确定的肺炎支原体M129-B7株菌体。将肺炎支原体(M129-B7株)在PPLO葡萄糖肉汤(含有马血清、新鲜酵母提取物、醋酸亚铊)中接种，在37°C在需氧条件下培养7日。洗涤离心回收的菌体后，将其在PBS中悬浮并冷冻处理。(2-1-2)利用亲和色谱的识别抗原的纯化
在CNBr-活化的S^harose 4B(GE ^ ^ ^ ^ 7社)上，使(I)中得到的单克隆抗体MCM12与柱载体结合，制备抗原纯化用亲和柱。对于与柱载体的结合，在0. I mo I/L NaHCO3-NaOH,
0.5 mo I/L NaCl (pH8. 3)下使IgG 5mg/mL凝胶在4°C反应过夜。未反应基团的封闭应用
0.2 mol/L甘氨酸缓冲液(pH8)。将从肺炎支原体菌体提取的蛋白质施用于柱，溶出非吸附级分后，利用3 mol/L硫氰酸钠溶出、回收柱吸附级分。将其用50mmol/L PBS (pH7)透析，作为纯化物。(2-2)取得单克隆抗体的识别蛋白质的鉴定 (2-2-1)识别蛋白质在SDS-PAGE上的分子量确认
将纯化抗原通过SDS-PAGE以及蛋白质印迹进行解析。将纯化抗原0. Iii g进行SDS-PAGE，接着在硝酸纤维素膜上印迹。将单克隆抗体MCM12或单克隆抗体MCM19的10 u g/mL IgG溶液分别添加在膜上，在室温反应I小时。用洗涤液洗涤3次后，添加1000倍稀释的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体，在室温反应I小时。用洗涤液洗涤3次后，添加基质(4-氯-I-萘酚)溶液，使其在室温反应。显色后，用蒸馏水洗涤，停止反应。可以确认，任一抗体都识别纯化抗原。(2-2-2)纯化抗原的N末端氨基酸序列解析
根据常规方法，解析纯化抗原蛋白的N末端10个氨基酸残基。将纯化抗原进行SDS-PAGE,将在PVDF膜上印迹的样本用50%甲醇/0. 1%三氟乙酸、甲醇洗涤后干燥，实施自N末端10个循环的氨基酸序列分析。在解析装置中，使用蛋白质测序仪PPSQ-23A (岛津制作所)和PTH分析仪SPD-10A (岛津制作所)。
其结果是，得到以下的序列。STDNGLIIGI (序列号 I)
根据常规方法，通过应用数据库Swiss-Prot的检索，得到的序列与肺炎支原体的伴侣蛋白DnaK的第2 11个残基的序列完全一致。另外，从该氨基酸序列推定的该DnaK的分子量是65KDa，与蛋白质印迹上的抗体识别抗原的分子量几乎一致。根据以上可以确认，上述取得的抗体是肺炎支原体以及生殖支原体特异性的抗DnaK抗体。实施例2 :利用ELISA法取得的抗体的灵敏度以及交差性的研究
在实施例I中得到的单克隆抗体内，使用单克隆抗体MCM12以及单克隆抗体MCM19对该抗体的灵敏度以及交差性进行研究。·(I)试验菌株的培养以及配制 (1-1)灵敏度试验用菌株
将表I中示出的肺炎支原体8株在PPLO葡萄糖肉汤(含有马血清，新鲜酵母提取物，醋酸亚铊)中接种，在37°C需氧培养4日，将肉汤的pH成为6.8的菌作为试验菌应用。对于肉汤中的菌数，用灭菌PBS制备10梯度稀释液，将其各稀释液在PPLO(含有马血清、新鲜酵母提取物、醋酸亚铊)琼脂培养基上IOy L接种后，在37°C培养10天。将琼脂培养基上的发育集落用40倍的光学显微镜测定集落数，算出菌数。[表 I]
权利要求
1.肺炎支原体或生殖支原体的检测方法，其特征是，以肺炎支原体或生殖支原体的DnaK为指标。
2.权利要求I中记载的方法，其中对DnaK蛋白质进行免疫学分析。
3.对肺炎支原体或生殖支原体具有特异性的抗DnaK抗体。
4.肺炎支原体或生殖支原体的检测用试剂盒，其含有权利要求3中记载的抗DnaK抗体。
5.权利要求I中记载的方法，其以DnaK基因为指标。
6.对肺炎支原体或生殖支原体具有特异性的引物或探针。
7.肺炎支原体或生殖支原体的检测用试剂盒，其含有权利要求6中记载的引物或探针。
全文摘要
提供了用于迅速且特异性地诊断肺炎支原体和/或生殖支原体感染病的检测方法以及检测试剂盒。其以肺炎支原体或生殖支原体的DnaK为指标。
文档编号C12N15/09GK102687019SQ201080054628
公开日2012年9月19日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月4日
发明者H.板垣, 岛田康司, 广岛丰正, 杉山和之, 水户部优树, 皆川温子 申请人:三菱化学美迪恩斯株式会社