专利名称：肺炎支原体检测用抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及到作为一般的肺炎病原微生物属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的微生物检测中有用的抗体、该微生物的检测方法、该微生物的检测用试剂盒、以及该微生物检测用抗体的制造方法。
本发明在医药业，特别是在由肺炎支原体引起的非典型肺炎的诊断中很重要，在医药产业上是有用的。
本发明在诸如从咽喉棉签、组织样品、体液实验用溶液和培养物采集的检测样品中含有的微生物肺炎支原体的检测中很有用。
感染症病原菌的检测一般分为经过病原菌的分离培养、根据其生理学上、生物化学上或结构上的特性对其进行鉴定的培养鉴定法；通过聚合酶链式反应(PCR)或特异的核酸杂交使病原菌的基因扩增，对该基因进行检测的基因诊断法以及利用抗体和病原菌的抗原标记物的特异反应检测病原菌的免疫学方法。
然而使用培养鉴定法或基因诊断法时，要获得结果花费的时间长。因此利用能够在短时间内、高灵敏度地对病原菌进行检测，迅速地与相应患者的治疗联系起来的免疫学方法的诊断被广泛采用。
以往在利用免疫学方法检测感染症病原菌时，使用因菌种各异的标记抗原和抗体的组合。
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是肺炎、支气管炎和咽喉炎的一般病原菌。是小的、类真菌的革兰氏阴性菌，有选择地侵入人体内，引起疾病。一般在社会上集团式发病的肺炎约15～20，以及被限定的集团内的肺炎达到50％，人们认为是由肺炎支原体引起的(Ragnar Norrby1999)。
该细菌是非常微小的难以培养的微生物，在浓厚培养基中形成小的菌落。在富营养化琼脂培养基中肺炎支原体的生长非常缓慢，能够在培养基中鉴定到细菌至少需要21日(Granato，Poe，et al.1980)。来源于人体内的几种支原体属(Mycoplasma)种微生物可引起同样的生物化学反应。另外由于没有细胞壁，使得在明亮的显微镜下观察更困难(Knudson和Macleod 1979)。因此作为迅速检测病原菌的诊断方法不能使用革兰氏染色法和培养法等。
肺炎支原体检测基因序列中使用的DNA杂交分析探针由Hyman等人、Buck等人和Bernet等人(Hyman，Yogev et al.1987；Bernet，Garret等1993；Buck，O’Hara等1993)已有报道。肺炎支原体核糖体RNA(rRNA)检测使用的探针由Tilton等人(Tilton，Dias等1980)、Yogev等人(Yogev，Halachmi等1988)、Gobel等人(Gobel，Geiser等1987)、ZiVin和Monahan(EPO 305145)以及Gobel和和Stanbridge(EPO 0250662)等都有报道。Kai等人(Kai，Kamiya等1987)和Jensen等人(Jensen，Songergard-和ersen等1993)等报道了肺炎支原体的16SrRNA序列的引物。这里叙述的所有探针都是针对肺炎支原体的DNA或肺炎支原体的DNA或尿殖道支原体(Mycoplasma genitalium)的DNA设计的。由于这些探针灵敏度比较高，通过最近成为可利用的技术PCR法可以捕捉它们。PCR法灵敏度非常高，而且可以在很短时间内进行杂交。但是往往存在着培养肺炎支原体阴性的无症状的人以及病愈后的带菌人表现出阳性的假阳性问题。
特开昭63-298号公报报道了以使用抗大约43kDa的肺炎支原体膜抗原蛋白质的单克隆抗体的Western印迹法作为基础的免疫检测法。但存在着上述抗体和使用该抗体的检测法特异性非常低，针对肺炎支原体种的特异性诊断不充分的问题。而且还存在着利用该诊断方法到得到结果至少要花费5小时以上时间的问题(Madsen et al.1988)。
发明概述本发明正是为了解决上述那样的课题而形成的发明。即，本发明将提供能够特异、而且高灵敏度迅速地检测属于肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)的微生物的方法，该检测中使用的检测用抗体、检测用试剂盒作为课题。另外本发明还将提供检测使用的抗体的制造方法作为课题。
本发明人发现了在所有微生物中保持同一功能的蛋白质可作为有用的抗原。通常人们预想这样的蛋白质结构变化非常小。然而令人吃惊的是抗该蛋白质抗体是微生物种或属特异性抗体，抗该蛋白质抗体在用于微生物种或属特异性识别可能具有多样性的同时，发现能够检测作为检测对象的微生物的所有血清型。更详细地讲该蛋白质经过氨基酸序列的变化在同一种类间结构完全相同，种类不同时，是表现出伴随着结构的变化的种特异性的有用的蛋白质。
本发明人着眼于以同一功能分子存在于所有微生物细胞的，而其氨基酸结构在微生物间有一定差异的细胞内分子、特别是一种核糖体蛋白-核糖体蛋白L7/L12蛋白质。已知核糖体蛋白L7/L12蛋白质是分子量约为13kDa的蛋白质，是蛋白质合成所必需的核糖体蛋白质。特别是在包括肺炎支原体在内的几种微生物中的核糖体蛋白L7/L12的全部氨基酸序列已被解析。
本发明人除了注意到该分子在微生物间类似之外，还注意到其一部分含有各个微生物固有的结构部分，发现通过利用抗该肺炎支原体的核糖体蛋白L7/L12蛋白质的抗体有可能对各种各样的微生物、细菌的种特异的、而且所有同一菌种内血清型进行检测。
本发明人通过得到的抗肺炎支原体的该蛋白的特异抗体，发现利用该抗体有可能对肺炎支原体进行特异性检测，直至完成了本发明。
本发明发现并开发了对肺炎支原体的核糖体蛋白L7/L12蛋白质特异的单克隆抗体。该抗体是新的抗体，与以往众所周知的任一抗体都不同，具有与上述蛋白质进行特异反应的性质。
序列表中序列1和2分别是肺炎支原体的核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列和对应的氨基酸序列(NCBI数据库查询码#NC#000912)。另外序列表记载的氨基酸序列的左端和右端分别是氨基末端(以下称为N端)和羧基末端(以下称为C端)，而碱基序列的的左端和右端分别是5’端和3’端。序列比对测试的氨基酸序列用氨基酸单字母缩写表示。而序列比对测试中「+」标记表示有差别的氨基酸，但疏水性等性质类似的氨基酸，「」中的空白表示包括性质在内都不相同的氨基酸。而本发明叙述的基因操作的一系列分子生物学实验根据通常实验书记载的方法进行。作为上述一般的实验书如《分子克隆实验手册》[Molecular Cloning，Alaboratory manual，Cold Spring Harber Laboratory Press，Sambrook，J.等人(1989)]。表1序列比对测试Mp1 MAKLDKNQLIESLKEMTIMEIDEIIKAVEEAFGVSATPVVAAGAVGGTQEAASEVTVKVT601 M KLDK QLIESLKEMTI+EIDEIIKAVEEAFGV+ATP+VAAGA G TQEAASEV+VKVTMg1 MGKLDKKQLIESLKEMTIVEIDEIIKAVEEAFGVTATPIVAAGAAGATQEAASEVSVKVT60Mp61 GYTDNAKLAVLKLYREIAGVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVE 120GY DNAKLAVLKLYREI GVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVEMg61 GYADNAKLAVLKLYREITGVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVE 120Mp121 IK 122+KMg121 VK 122本发明中所谓“微生物”指的是肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)，特别是指呼吸器官中有病原性作为支原体感染症的病原菌有很高诊断意义的微生物。本发明中所谓“与微生物进行特异反应的抗体”指的是与微生物种或属进行特异反应的抗体，在微生物感染症的诊断中对微生物种进行特异反应的抗体特别有用。
本发明中的抗体指的是多克隆抗体或单克隆抗体，可以通过使用核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的全长或其部分肽制备。制备抗体用的肽的长度没有特别限定，在制备抗核糖体蛋白L7/L12蛋白质抗体时，只要是赋予该蛋白质特征的长度都可以，优选是5个氨基酸以上，特别优选使用8个氨基酸以上的肽。将该肽或全长蛋白质直接、或与称之为KLH(匙孔鲎血蓝蛋白keyhole-limpet hemocyanin)的载体蛋白质搭桥后根据需要同时与佐剂一起接种动物，通过回收该血清，可以获得含有识别核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的抗体(多克隆抗体)的抗血清。也可以从抗血清中纯化出抗体后再使用。作为接种的动物有羊、马、山羊、兔、小鼠、大鼠等，特别是在制备多克隆抗体时，优选羊、兔等。另外利用制备骨髓瘤细胞的众所周知的方法也可以获得单克隆抗体，此时优选小鼠。
对将该蛋白质的全长或5个残基以上、最好是8个残基以上的氨基酸序列与谷胱甘肽S-转移酶(GST)等作成融合蛋白的产物进行纯化、或也可以不纯化直接用作抗原。
可以通过已出版书(《抗体实验手册》Antibodiesa laboratorymanual，E.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory)给出的各种方法以及基因克隆法等使用分离到的免疫球蛋白基因，使其在培养的细胞中表达的基因重组抗体来制备。
可以用作本发明的标记抗原的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的抗体可以通过以下方法或其类似的其它方法获得，但不限定于这些方法。a)对于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的基因序列和氨基酸序列已知的微生物来说，通过合成与其它微生物中该蛋白质的氨基酸序列类似性少区域的肽段，以此作为免疫原制备多克隆抗体、或单克隆抗体来获得目的抗体。
另外通过以已知的该基因的两端部位的DNA序列作为探针的PCR法进行的基因扩增、以相同部分序列作为模板探针的杂交法等通常的基因操作手法可以获得该基因的全长序列。
然后构建与其它蛋白质基因的融合基因，以大肠杆菌为宿主通过众所周知的基因导入法将该融合基因插入到宿主内，使其大量表达后，利用抗融合蛋白质的抗体亲和柱法等纯化表达蛋白质，可以获得目的蛋白质抗原。此时由于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质作为抗原，所以即便获得了针对微生物间保守氨基酸部分的抗体也不符合本发明的目的。因此，对于按照本方法获得的抗原，通过众所周知的手法可以获得产生单克隆抗体的杂交瘤，通过选择只与该微生物反应的抗体的克隆可以获得目的抗体。b)对于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列未知的微生物来说，其一，由于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列在微生物种间有50～60％同源性，首先以该氨基酸序列相同部分的序列为基础利用PCR法对特定序列部分进行扩增和通过以同源部分序列作为探针的杂交法等通常的基因操作手法可以很容易地获得该蛋白质的基因。
然后构建与其它蛋白质基因的融合基因，以大肠杆菌为宿主通过众所周知的基因导入法将该融合基因插入到宿主内，使其大量表达，利用抗融合蛋白质的抗体亲和柱法等纯化表达蛋白质，可以获得目的蛋白质抗原。此时由于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质作为抗原，所以即便获得了针对微生物间保守氨基酸部分的抗体也不符合本发明的目的。因此，对于按照本方法获得的抗原，通过众所周知的手法可以获得产生单克隆抗体的杂交瘤，通过选择只与该微生物反应的抗体的克隆可以获得目的抗体。c)或者作为核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列未知的情况下的其它方法，可以制备相当于在已知的对于核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列中微生物间保守的共同序列部分5～30氨基酸的合成肽，利用众所周知的方法制备针对该肽序列的多克隆抗体或单克隆抗体。通过使用该抗体的亲和柱层析通过对目的微生物的细胞破碎液进行纯化，可以获得高度纯化的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质。
蛋白质的纯度不够时可以通过众所周知的纯化手法-离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等手法纯化后通过利用制作的抗体的Western印迹等方法对核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的洗脱级分进行鉴定，可以获得纯化的蛋白质。以得到的纯化的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质抗原作为基础通过众所周知的方法获得杂交瘤，通过选择与目的微生物进行特异反应的杂交瘤可以获得目的抗体。
通过上述方法a)、b)和c)得到的对各种微生物特异的本发明的抗体可以用于使用对靶微生物特异的各种诊断试剂和试剂盒的各种免疫学分析方法中。例如，该抗体可以用于作为众所周知测定方法的使该抗体吸附于聚苯乙烯胶乳粒子上的凝集反应、在微滴板中进行的众所周知技术ELISA法、已有的免疫层析法、使用着色粒子或具有发色能力的粒子、或被捕捉(capture)抗体和用酶或荧光物标记的该抗体一起包被的磁微粒子等夹层分析等已知的所有的免疫测定手法。
所谓使用抗体的微生物诊断方法指的是利用使该抗体吸附于聚苯乙烯胶乳粒子上的凝集反应、在微滴板中进行的众所周知技术ELISA法、已有的免疫层析法、使用着色粒子或具有发色能力的粒子、或使用被捕捉(capture)抗体和用酶或荧光物标记的该抗体一起包被的磁微粒子等夹层分析等已知的所有免疫测定手法的诊断方法。
另外，作为使用抗体的特别有用的微生物诊断方法通过在由特表平7-509565号公报记载的硅、氮化硅等形成的光学薄膜上进行的抗体反应通过光干涉原理等进行检测的所谓光免疫分析法(OIA，OpticalImmunoassay)等作为高灵敏度的诊断方法很有用。
而在该检测方法中所必需的来自微生物细胞内标记抗原的提取方法可以利用通过使用TritonX-100，Tween-20为代表的各种表面活性剂的萃取试剂的处理法、使用适当的蛋白酶等酶的酶处理法、通过物理方法使微生物细胞破碎等已知的细胞结构的破碎方法。希望通过表面活性剂等的组合对于每种微生物设定使用试剂进行的最适萃取条件。
而所谓本发明中利用抗体的微生物检测用试剂盒相当于利用该检测方法的检测用试剂盒。
肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列及其DNA序列如序列表所示。因此，可以将该微生物的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的氨基酸序列与序列表记为序列比对的类似的微生物的同种蛋白质进行比较。合成同源性低部分的肽，制备抗该肽多克隆抗体或单克隆抗体有可能省略对微生物具有特异性的抗体的选择。
特别是多克隆抗体的情况，将免疫的动物的抗血清利用Protein A柱进行纯化，获得IgG级分之后，希望进一步通过动物免疫用合成肽的亲和层析进行纯化。
另外根据来自该微生物的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的DNA序列的N末端和C末端的序列制备PCR引物。
利用该PCR引物的同源性，使用基因组DNA通过PCR法使DNA片段扩增，对DNA片段进行萃取，按照常规方法可以获得肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12基因的片段。肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12基因的全长通过分析这些片段的DNA序列信息可以确定。
得到的肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12基因构建成例如与GST等的融合蛋白质基因，使用适当的表达用质粒构建表达载体后，转化大肠杆菌，可以使该蛋白质大量表达。对转化的大肠杆菌进行适当培养，通过使用GST的亲和柱对菌体破碎液进行纯化，可以得到肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质与GST的融合蛋白质。
可以将该蛋白质直接、或切断GST部分后作为抗原蛋白质利用众所周知的手法建立多个杂交瘤克隆，通过选择对肺炎支原体菌体或菌体破碎液或肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质表现出特异反应的抗体，也可以得到目的特异单克隆抗体。
根据本发明制作的抗体可以用于作为众所周知的测定方法的使该抗体吸附于聚苯乙烯胶乳粒子上的凝集反应、作为微滴板中进行的众所周知技术ELISA法、已有的免疫层析法、着色粒子或具有发色能力的粒子、或使用被捕捉抗体和用酶或荧光物标记的该抗体一起被包被的磁微粒子等夹层分析等已知的所有免疫测定手法。
根据本发明制作的抗体在所有免疫测定手法中可以作为在固相或液相中捕获该抗原蛋白质的所谓捕捉抗体发挥作用的同时，通过利用众所周知的方法对过氧化物酶和碱性磷酸酶等酶进行修饰的酶标记抗体也可作为检测用抗体发挥作用。
来自肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12基因的克隆将适当量的肺炎支原体(ATCC 15531、从ATCC购入)接种于加了Mycoplasma Supplement(DIFCO，0836-68-9)的PPLO琼脂培养基(DIFCO，0412-17-3)上，在CO2培养箱内于37℃、5％CO2条件下培养5小时。将生成的菌落悬浮于TE(和光纯药工业生产)缓冲液，使最终浓度达到5×109CFU/ml左右。将约1.5ml该悬浮液移至微量离心管中于10,000rpm下离心2分钟。弃掉上清，沉淀部分再悬浮于567μl的TE缓冲液。然后加入30μl的10％SDS和3μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，充分混合，于37℃下温育1小时。悬浮液再于56℃下温育1小时。然后加入80μl的10％的十六烷基三甲基铵溴化物/0.7M NaCl溶液，充分混合之后，于65℃下温育10分钟。加入700μl的同一体积的24∶1的氯仿-异戊醇混合液，充分搅拌。
将该溶液用微量离心机于12000rpm、4℃下离心5分钟之后，将水相级分移至新的微量离心管中。然后向该离心管中加入0.6倍量的异丙醇，充分振荡离心管，形成DNA沉淀。用玻璃棒将白色的DNA沉淀捞出，移至加了1ml的70％乙醇(-20℃冷却的)的另一个微量离心管中。然后将该离心管于10,000rpm下离心5分钟，将上清轻轻地除去。追加1ml的70％乙醇，将混合物再离心5分钟。
再将上清除去之后，将沉淀溶解于100μl的TE缓冲液中，得到DNA溶液。根据《分子克隆实验手册》Molecular Cloning，A laboratory manual，1989，Eds.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，Cold SpringHarber Laboratory Press的E5，DNA或RNA量的分光光度法测定(Spectrophotometric Determiantion of the Amount of DNA or RNA)对该基因组DNA溶液的浓度进行定量。
从该基因组DNA中取出10ng进行PCR(polymerase chain reaction)。PCR使用Taq聚合酶(宝酒造公司生产、编号R001A)。将酶附带的缓冲液5μl、酶附带的dNTP混合物4μl和各200pmol的寡核苷酸(序列表中序列3和4所示)加到酶中。加水使总容积达到50μl。
使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480，对该混合物进行5次95℃1分钟、50℃2分钟、72℃3分钟的循环之后，再进行25次95℃1分钟、60℃2分钟、72℃3分钟的循环。使用一部分PCR产物，于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。用溴乙锭(日本基因公司生产)染色后，于紫外线下观察，确认约400bp的DNA被扩增了。使用限制酶BamHI和XhoI进行酶切后，再于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳和用溴乙锭染色。从凝胶中切出约400bp的带。该带用Suprec01(宝酒造株式会社生产)纯化，插入作为一般载体的pGEX-6P-1(Pharmacia公司生产)中。该载体通过将目的基因片段整合到适当的限制酶的位点，可以作为能够表达与GST蛋白质融合的融合蛋白质的目的分子表达载体发挥作用。
具体来说是将载体pGEX-6P-1和先前的DNA以摩尔比为1∶3那样比例混合，通过T4DNA连接酶(Invitrogen公司生产)将DNA整合到载体中。整合了DNA的载体pGEX-6P-1通过基因手法导入到大肠杆菌的瞬时感受态细胞，然后接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素(Sigma公司)的半固体状培养板的LBL-肉汤琼脂(宝酒造株式会社)。将培养板于37℃下温育12小时，对生长的菌落进行随机选择，接种到含有同浓度的氨苄青霉素的L-肉汤培养液中。于37℃下振荡培养8小时，收集菌体后，使用Wizard Miniprep，根据附带的说明书分离质粒。该质粒用限制酶BamHI/XhoI进行酶切处理。通过对约370bp的DNA进行酶切确认PCR产物插入。使用上述克隆确定插入的DNA碱基序列。
利用Applied Biosystems公司生产的荧光测序仪确定插入DNA片段的碱基序列。
使用PRISM，Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司生产)制备测序样品。首先将9.5μl的反应液、4.0μl的0.8pmol/μl的T7启动子引物(Gibco BRL)和6.5μl的0.16μg/μl模板DNA加到0.5ml的微量管中，进行混合。该混合物用2层的100μl矿物油覆盖后，进行25循环PCR扩增处理。每一循环为96℃处理30秒、55℃处理15秒和60℃处理4分钟。生成物于4℃下保存5分钟。反应结束后，加80μl的无菌纯化水，搅拌。将生成物离心，水相用苯酚-氯仿混合液萃取3次。将10μl的3M醋酸钠pH5.2和300μl的乙醇加到100μl的水相中，搅拌。然后于14,000rpm、室温下离心15分钟，回收沉淀。用75％乙醇洗沉淀，真空下静置2分钟，使其干燥，作为测序样品。测序样品溶解在含有4μl的10mM的含有EDTA的甲酰胺之后，于90℃下变性2分钟。该变性溶液于冰中冷却之后供测序用。
随机选择的5个克隆中的2个与PCR使用的探针有序列上的同源性。而与核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的基因序列一致的DNA序列已经清楚。该结构基因部分的全碱基序列以及对应的氨基酸序列是序列表中序列1和2所示的那样序列。显然该基因片段是编码肺炎支原体的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的基因。
然后使上述上清液吸附于用PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖柱。用含有20mM Tris缓冲液pH7.4、4.2mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)洗涤液(2倍柱体积)洗柱子，用含有5mM谷胱甘肽的50mM pH9.6 Tris缓冲液进行洗脱，洗脱级分的蛋白质含有量用色素结合法(Bradford法；BioRadCo.)确定，得到主要级分。
得到的纯化的GST融合核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的纯度通过电泳方法确认，纯度约为75％，作为免疫原可确保有充分纯度。实施例3抗肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体的制备首先在免疫小鼠时，将肺炎支原体的GST融合核糖体蛋白L7/L12蛋白质抗原100μg溶解于200μl的PBS后，加入200μl弗氏完全佐剂，进行混合。乳化后向腹腔内注入200μl。2周后、4周后和6周后向腹腔内注入同样的乳化抗原。10周后和14周后向腹腔内注入2倍浓度的乳化抗原。最后免疫结束后3天摘取脾脏，进行细胞融合。
相对于无菌摘取的108个小鼠脾细胞加入骨髓瘤细胞2×107个，用玻璃管充分混合之后，于1500rpm离心5分钟，弃掉上清，然后将细胞充分混合。
细胞融合使用的骨髓瘤细胞使用NS-1系的细胞株于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养，从细胞融合2周前开始用含有0.13mM的氮杂鸟嘌呤、0.5μg/ml的MC-210、10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养1周后，再用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养1周。
将保持在37℃的RPMI 1640培养液50ml加到混合细胞样品中，经15,000rpm离心分离，除去上清液，加入保持在37℃的50％聚乙二醇1ml，搅拌1分钟。加入保持在37℃的RPMI1640培养液10ml，通过用灭菌的吸液管对混合液进行大约5分钟的吸、吹，进行更激烈搅拌。
于1,000rpm下离心分离5分钟，除去上清后，加入30mL HAT培养液使细胞浓度达到5×106/ml。对该混合液进行搅拌直至均一为止，然后加入到96孔板中，每孔0.1ml，于37℃、7％二氧化碳氛围下进行培养。在第1天、第1周和第2周每孔各加入0.1ml的HAT培养基，通过ELISA法筛选产生目的抗体的细胞。
溶解在含有0.05％叠氮钠的PBS中的GST融合核糖体蛋白L7/L12蛋白质和GST蛋白质分别稀释到10μg/ml浓度后的稀释液分别加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附过夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室温反应1小时，进行封闭。除去上清后，生成物用洗涤液(0.02％Tween，PBS)洗净。然后加入融合细胞的培养液100ml，于室温反应2小时。除去上清，用洗涤液洗沉淀。然后加入浓度为50ng/ml的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体溶液100μl，使混合物于室温下反应1小时。除去上清，生成物再用洗涤液洗净。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生产)，使混合物于室温下反应20分钟。显色时加入100μl 1N硫酸终止反应，测定450nm的吸光度。
结果表明出现了只对GST融合核糖体蛋白L7/L12蛋白质反应，而对GST蛋白质不反应的阳性孔，这样的孔含有抗核糖体蛋白L7/L12蛋白质抗体。
然后分别回收阳性孔中的细胞，加到24孔的塑料板中用HAT培养基进行培养。
用HT培养基对培养的融合培养基进行稀释，使细胞数达到约20个/ml，取其中的50μl与悬浮于HT培养基的6周龄的小鼠胸腺细胞106个于96孔板中进行混合。混合后，于7％CO2、37℃条件下培养2周。
使用上述的ELISA法对培养上清中的抗体活性进行同样的测定，回收与核糖体蛋白L7/L12蛋白质反应呈阳性的细胞。再反复进行同样的稀释测定、克隆操作，得到5个克隆的杂交瘤MPRB-1～5。
具体来说，将用RPMI1640培养基(含有10％FCS)进行传代培养的细胞5×106个(PBS中)注射到2周前预先已向腹腔内注射了0.5ml的降植烷的Balb/C小鼠的腹腔内。3周后回收腹水，获得该腹水的离心上清。
使得到的抗体溶液吸附于Protein A柱(5ml，Pharmacia生产)上，用3倍量的PBS洗涤。然后用pH3柠檬酸缓冲液进行洗脱。回收抗体级分，得到由各个杂交瘤产生的单克隆抗体。通过ELISA法对来自这5株杂交瘤的单克隆抗体进行评价。
在单克隆抗体的评价中使用夹层分析法。通过使制备的单克隆抗体与过氧化物酶结合，用作检测用抗体。
酶标记使用辣根过氧化物酶(Sigma grade VI)，结合中使用试剂S-乙酰硫代醋酸N-羟基琥珀酰亚胺，根据Analytical Bio-chemistry132(1983)，68-73报道的方法进行。在ELISA反应中将市售的抗肺炎支原体多克隆抗体(兔)以10μg/ml浓度稀释后的稀释液100μl分别注入96孔板中，于4℃下吸附过夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室温反应1小时，进行封闭。除去上清后，生成物用洗涤液(0.02％Tween 20，PBS)洗净。然后向上述洗净的生成物加入100μl抗原溶液(该抗原溶液是通过向各个微生物培养液加入浓度达到0.3％的量的Triton X-100，于常温下萃取5分钟得到的)，于室温反应2小时。除去上清，生成物再用洗涤液洗净。然后加入浓度为5μg/ml的过氧化物酶标记的抗核糖体蛋白L7/L12蛋白质抗体溶液100μl，于室温下反应1小时。除去上清，生成物再用洗涤液洗。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生产)，使混合物于室温下反应20分钟。显色时加入100μl 1N硫酸终止反应，测定450nm的吸光度。
作为标记抗体使用来自杂交瘤MPRB-1的单克隆抗体时，通过使用在106个/ml的灵敏度下检测实验的肺炎支原体所有菌株的同时，而对其它的流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae，肺炎克氏杆菌Klebsiellapneumoniae，肺炎支原体Chlamydia Mycoplasma pneumoniae以及脑膜炎奈瑟球菌Neisseria meningitides等微生物即使在108个/ml的高浓度也没有反应性的抗核糖体蛋白L7/L12蛋白质单克隆抗体，可以明确地确认获得具有肺炎支原体特异的反应性的抗体。该抗体被命名为AMMP-1。表2只给出了使用AMMP-1的结果。使用与别的微生物表现交叉反应的其它抗体的结果这里没有涉及。表2
(+阳性，-阴性)
抗体效价的确认通过ELISA法实施。溶解在含有0.05％叠氮钠的PBS中的肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质以10μg/ml稀释后的稀释液分别加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附过夜。除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室温反应1小时，进行封闭。除去上清后，生成物用洗涤液(0.02％Tween 20，PBS)洗净。然后加入正常的兔血清和免疫的兔的抗血清经稀释后得到的溶液100μl，于室温反应2小时。除去上清，生成物再用洗涤液洗净。然后加入浓度为50ng/ml的过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体溶液100μl，于室温下反应1小时。除去上清，生成物再用洗涤液洗。各加入100μl的OPD溶液(Sigma公司生产)，使混合物于室温下反应20分钟。显色时加入100μl 1N硫酸终止反应，测定492nm的吸光度。
确认抗体效价上升后，实施大量采血。从耳动脉将血液采集到玻璃离心管中，于37℃放置1小时后，于4℃下静置过夜。然后于3000rpm离心5分钟，回收上清。得到的抗血清保存在4℃下。
制备固定了肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质亲和柱。使用HiTrapNHS活化柱(1ml，Pharmacia公司生产)。用1mM HCl置换柱子后立即加入核糖体蛋白L7/L12蛋白质的PBS溶液(1mg/ml)。将柱子静置30分钟后，加入封闭试剂，用PBS进行平衡。
使用这个肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质固定化亲和柱，对用肺炎支原体经Triton X-100处理的菌体的上清作为抗原得到的抗血清中的多克隆抗体进行纯化。将该抗血清用PBS稀释5倍，用0.45μm的膜过滤后，以流速0.5ml/min吸附于肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质固定化柱。然后用0.1M pH2.1甘氨酸缓冲液从柱子上洗脱出来后，立即用1M pH9.0 Tris缓冲液中和后，通过与抗体效价测定方法同样的ELISA法回收目的抗体的洗脱级分。
这样得到的多克隆抗体通过特表平7-509565号公报记载的OIA法进行评价。
纯化的抗体作为OIA法的捕捉抗体使用。作为检测抗体使用实施例4记载的AMCT-1单克隆抗体经过氧化物酶标记的抗体。酶标记使用辣根过氧化物酶(Sigma grade VI)，结合中使用试剂S-乙酰硫代醋酸N-羟基琥珀酰亚胺，根据Analytical Bio-chemistry 132(1983)，68-73报道的方法进行。
在OIA反应中含有0.05％叠氮钠的PBS中的纯化多克隆抗体用0.1MpH8.0 HEPES缓冲液稀释到10μg/ml后的稀释液(50μl)分别加到硅晶片上，于室温下反应30分钟后，用蒸馏水洗净，用含有蔗糖以及碱处理干酪素的包被溶液进行包被后使用。
然后向上述硅晶片加入通过向上述操作得到的各个微生物培养液加入浓度达到0.5％的量的Triton X-100，于常温下萃取5分钟得到的抗原溶液15μl，于室温反应10分钟。然后加入20μg/ml的过氧化物酶标记的单克隆抗体溶液15μl，于室温下反应15分钟。用蒸馏水洗净后，各加入15μl的TMB溶液(KPL公司生产)，使混合物于室温下反应5分钟。生成物用蒸馏水洗净，用肉眼可以观察到通过酶反应生成的蓝色。
结果就象表3所示的那样，表明通过将纯化多克隆抗体APMP-1作为捕捉抗体使用，可以以108个/ml的灵敏度检测肺炎支原体，但不能检测其它微生物的反应性。因此可以通过固定了肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质的亲和柱，确认获得了对肺炎支原体特异反应的多克隆抗体。表3
(+阳性，-阴性)
通过本发明不仅可以利用针对在微生物进化过程中保持功能的细胞内分子的抗体对特定种类的微生物进行特异检测，而且可以高精度地检测同一种内的所有血清型微生物。
作为这样的抗体可以使用针对微生物核糖体蛋白质、核糖体蛋白质L7/L12蛋白质的抗体对肺炎支原体进行高精度地检测。
另外通过使用这样抗体为组成成分的微生物检测试剂盒，可以对微生物进行更广泛、精度更高地检测。
引用文献专利文献*美国专利No.5,552,279、Weisburg，et al.，1996年9月3日，「肺炎支原体和尿殖道支原体检测用核酸探针」。*EPO 305145，申请号88307793.5 Zivin和Monahn.1989年3月1日.检测核酸的方法和探针。*EPO 250662，申请号86304919，3 Gobel和Stanbridge.1988年1月7日，DNA杂交检测支原体。*特开昭63(1988)-298其它专利文献*Bernet，C.，M.Garret，等，(1993)「利用聚合酶链式反应检测肺炎支原体」J Clin Microbiol 31(4)，1013-5*Buck，G.E.，LC.O’Hara等(1993)「利用DNA增殖迅速且高灵敏度地检测有疑问的临床样品中肺炎支原体的方法」J Clin Microbiol 31(4)，1013-5*Gobel，U、B.，A.Geiser等1987「与Mycoplasma种间的核糖体RNA有差别可变区互补的多核苷酸探针」*Granato.P.A.，L.Poe，等，(1980)「有关在肺炎支原体生长中利用改进的New York City培养基的报告书」Zh Mikrobiol EpidemiolImmunobiol(8)，50-3*Hyman，H.，D.Yogev等(1987)「肺炎支原体和肺炎支原体的检测和鉴定用DNA探针」*Jensen，J.S.，J.Songergard-和ersen等(1993)「利用聚合酶链式反应检测有疑问的临床样品中的肺炎支原体」*Kai，M.，S.Kamiya等(1987)「利用聚合酶链式反应迅速检测肺炎支原体的方法」J Gen Microbiol 133(Pt7)，1969-74*Knudson，D.L.和R.Macleod(1979)「肺炎支原体和唾液支原体(Mycoplasma salivarium)在琼脂中菌落生长的电子显微镜照片」SciRep Res Inst Tohoku Univ[Med]26(3-4)，71-91*Madsen RD，Weiner LB，Mcmillan JA，Saeed JA，North JA，Coates SR.(1988).通过单克隆抗体免疫印迹分析直接检测临床样本中的肺炎支原体抗原Am J Clin Pathol 89(1)95-9*Rannar Norrby，S.(1999)「北欧诸国的代表性肺炎、其病因与氟罗沙星以及多西环素的临床比较结果」J Med Microbiol 48(12)，1115-22*Tilton，R.C.，F.Dias，等，(1980)「临床样品中的肺炎支原体检测用DNA探针和培养」J Clin Microbiol 12(6)，748-52*Yogev，D.，D.Halachmi，等(1988)「利用rRNA基因探针和基因组DNA指纹图检测Mycoplasma种和Mycoplasma株(mollicutes)」J ClinMicrobiol 26(11)，2266-9*Chan ED，Kalayanamit T，Lynch DA，Tuder R，Arndt P，WinnR.Schwarz MI.「引起成年人重度肺病与肺炎支原体有关的细支气管炎-文献综述」Chest.，1999；115(4)，1188-94*NCBI数据库#NC#000912.Himmelreich，R.，Hilbelt，H.，Plagens，H.，Pirkl，E.，Li，B.C.，和Herrmann，R.*Cimolai N.「由肺炎支原体引起的呼吸器官感染症」Pediatr Rev.，1998；19(10)，327-31*Harlow，E.，和D.Lane(1988)「抗体实验手册」NewYork.，Cold SpringHarbor Laboratory Press*Shambrook.J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis.，(1989)「分子克隆实验手册，第2版」Cold Spring Harbor Laboratory Press
序列表<110>旭化成株式会社<120>肺炎支原体检测用抗体<130>ASAHI-8<150>JP 2000-062729<151>2000-01-31<160>4<210>1<211>369<212>DNA<213>肺炎支原体Mycoplasma pneumoniae<400>1atg gca aaa cta gat aaa aac caa tta att gaa tcg ttg aag gaa atg 48Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met1 5 10 15acc atc atg gaa atc gat gaa atc att aag gct gta gaa gaa gct ttt 96Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe2025 30gga gta tcg gca aca cct gta gta gct gct ggt gct gtt ggt ggt aca 144Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr3540 45caa gaa gct gct agc gaa gtg act gtg aaa gtt act ggt tac act gac 192Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp5055 60aac gct aaa tta gct gtg tta aag ctt tac cgc gaa att gct ggt gtt 240Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val65 70 75 80ggt tta atg gaa gct aaa act gct gtg gaa aaa ctt cct tgt gtt gtt 288Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val85 90 95aag caa gac atc aaa cct gaa gaa gct gaa gaa ctt aaa aag cgt ttc 336Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe100105 110gtt gaa gtt gga gca act gtt gaa atc aaa taa 369Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys115 120<210>2<211>122<212>PRT<213>肺炎支原体Mycoplasma pneumoniae<400>2Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met1 510 15Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe2025 30Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr3540 45Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp50 55 60Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val65 70 75 80Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val85 90 95Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe100105 110Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys115120<210>3<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于从肺炎支原体获得核糖体蛋白质L7/L12基因使用的PCR引物DNA<400>3aatggatcca tggcaaaact agataaaaa29<210>4<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于从肺炎支原体获得核糖体蛋白质L7/L12基因使用的PCR引物DNA<400>4tgactcgagt tatttgattt caacagttgc30
权利要求
1.抗属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的微生物的核糖体蛋白质的抗体，是对该微生物特异反应的抗体。
2.权利要求1记载的抗体，其中属于肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)的微生物的核糖体蛋白质是核糖体蛋白质L7/L12。
3.权利要求1或2记载的抗体，其中抗体是单克隆或多克隆抗体。
4.权利要求1-3任一项记载的抗体，其中抗体是与酶结合的抗体。
5.属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)微生物的检测方法，其特征是使用权利要求1-4任一项记载的抗体。
6.属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)微生物的检测方法，该方法由以下a)、b)和c)构成a)通过使检测样品与溶解液接触，从微生物中提取核糖体蛋白质、b)提取的检测样品通过与捕捉抗体，即权利要求1-4任一项记载的抗体被固定于固体表面上的抗体接触，在核糖体蛋白质和捕捉抗体之间形成抗原抗体复合物以及c)使用检测用抗体、即权利要求1-4任一项记载的抗体对抗原抗体复合物进行检测。
7.权利要求6记载的方法，其中检测用抗体是与酶结合的抗体，抗原抗体复合物是通过该酶的特异底物可被检测的复合物。
8.属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)微生物的检测用试剂盒，其特征是使用权利要求1-4任一项记载的抗体。
9.权利要求1-3任一项记载的抗体的制造方法，其特征是将通过基因操作或从微生物分离纯化得到的属于肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)微生物的核糖体蛋白质L7/L12蛋白质、其部分肽、或相当于其部分肽的合成肽作为免疫原。
全文摘要
本发明提供能够特异、而且高灵敏度迅速地检测属于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的微生物的方法，该检测中使用的检测用抗体、检测用试剂盒、以及检测中使用的抗体的制造方法。作为抗属于肺炎支原体的微生物的核糖体蛋白质的抗体是可特异与该微生物反应的抗体。使用该抗体检测样品中的该微生物的方法以及含有该抗体的检测用试剂盒。作为核糖体蛋白质如核糖体蛋白L7/L12蛋白质，用于肺炎病原微生物的感染检测。
文档编号C12P21/08GK1406279SQ01805728
公开日2003年3月26日 申请日期2001年1月31日 优先权日2000年1月31日
发明者M·拉曼, 江藤高志 申请人:旭化成株式会社