专利名称：检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片及其检测方法
检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片，尤其涉及一种检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片及其检 测方法。
背景技术：
沙门氏菌是一群寄生在人类和动物肠道中能引起食物中毒并导致出现胃肠炎、伤 寒和副伤寒等症状的细菌，分类属肠杆菌科沙门氏菌属(Salmonella)，是重要的食源性致 病菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫等。 人感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状。1985年以来，在世界范围内，由食 源性沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，1999年美国发生了由食用冰激凌引 起的沙门氏菌疾病，有22400人患病；2002年，一批西班牙出口的鸡蛋因含有沙门氏菌，造 成英国有史以来最严重的疾病感染；2005年9月25日，洪都拉斯有600多人因食用了被沙 门氏菌污染的鸡而发生食物中毒；2005年11月，澳大利亚超市销售的紫花苜蓿芽、绿豆、 豆芽和其它芽菜被沙门氏菌污染，造成100多人食物中毒，其中包括部分幼儿。据美国The EconomicResearch Service(ERS)估计，美国每年由食源性致病菌引起的疾病约200万起， 其中沙门氏菌引起的病例达141万起，居首位，由此引起的直接、间接经济损失达30亿美兀。沙门氏菌是一群生化反应和抗原结构相关的革兰氏阴性杆菌，根据生化反应、DNA 同源性等，Popoff等将沙门菌属分为肠道沙门菌(S. enterica)和邦戈沙门菌(S. bongori) 两个种。肠道沙门菌又分为6个亚种，即肠道亚种(Subsp. enterica)、萨拉姆亚种(subsp. salamae)、亚禾亚禾中(subsp. enterica)、双亚禾亚禾中(subsp. diarigonae) ,MM 亚种(subap. houtenae)和英迪加亚种(subsp. indica)。沙门菌属下分血清型2463个，计 有肠道亚种1454个，萨拉姆亚种489个、亚利桑那亚种94个、双亚利桑那亚种324个、豪 顿亚种70个和英迪加亚种12个血清型，邦戈沙门菌仅20个血清型。沙门氏菌的危害有血清型差异，部分血清型危害严重(如伤寒杆菌群)，有的危害 较轻，所以区分沙门氏菌血清型显得相当重要。目前国内、国际上还主要采用生化反应和血 清凝集来进行血清型鉴定，由于生化反应主要以表型特征为依据，易受环境的变化而发生 改变，而血清凝集反应可能发生种属间交叉反应。另外传统培养法操作复杂，耗时长，特别 是不能适应口岸快速检测的要求。世界各国的学者都在致力于发展一种高特异性、高敏感性的快速、简便的检测方 法，如金标试纸法、ELISA法、自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)筛选法、PCR方法、多重 PCR方法、荧光PCR法、rDNA指纹图谱、RFLP等。然而，目前国内、国外众多方法均不能很好 地解决沙门氏菌属及其属下种群和血清型的高通量、快速鉴定问题。基因芯片技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术，基 因芯片又称DNA芯片，属于生物芯片的一种，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段 有序地、高密度地排列固定于支持物上，待测的样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点按碱基配对原理进行杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等方法对芯片进 行扫描，检测杂交信号的强弱进而判断靶基因分子的数量。基因芯片具有传统的检测方法 不可比拟的优点微型化、高通量、并行处理、快速分析、高准确性、高灵敏度、定量分析等， 可同时对沙门氏菌属及其属下种群和血清型进行鉴定。目前尚无采用基因芯片技术对沙门氏菌进行高通量、多基因快速检测并鉴定血清 型，尚无沙门氏菌血清型检测国家标准及检验检疫行业标准。
发明内容本发明的目的是提供一种检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片，其对沙门氏菌血 清型的检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。为实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片，其特征在于，将用于检测沙门氏菌血 清型的靶基因viaB、tyv、fliC-a、fliCl、rfbJ、fliC2、invA、hilA的探针整合于同一张芯 片上，其中各靶基因的探针序列分别为TTCAGAATTA ACCGTAAGGA TATAGTAAAG ATGAAATATT ；AGTTTGTACA TGGTGATATT CGCAACAAAA ATGATGTTAC ；ATACTGGTTC AATTAAGGAT GGTAAGGTTT ACTATAACAG ；ACTCTCAGAC CCTGGGTCTG GATACGCTGA ATGTGCAACA ；TTGCGTGAAA TGTACAACAG GCGAACAGAT AAGAGACTTT ；TTACGCGACT GTCAGTGGAT ACGATGATGC CGCAGATACA ；TGTCCTTTGG TATTAATCCA ACAATCCATC AGCAAGGTAG ；GGCGATGAAT TACGCTCACA ACACCTGCAG GATAATCCAA。其中，所述基因芯片采用硅基生物传感器芯片。本发明还提供了一种检测沙门氏菌血清型的方法，其特征在于，包括以下步骤
1)提取被检测物质的染色体DNA ；2)使用生物标记素标记引物；3)使用上述被标记的引物以聚合酶链反应方法来扩增所述染色体DNA中包含靶 基因viaB或tyv或fliC- α或fliCl或rfbj或liC2或invA或hilA的基因片段；4)将上述扩增产物与权利要求1所述的复合基因芯片进行杂交；5)检测复合基因芯片的杂交信号。步骤2)中所述的引物为与靶基因 viaB、tyv、fliC-α、fliCl、rfbJ、fliC2、invA、 hilA分别相应的八种引物，其中八种引物序列分别为viaB引物序列正GCGGCAACATCAGTCCAG，反GCGGCTCACGTACTCCAAAT；tyv引物序列正GCTTCCTTGGGAGTAATCTTGCC，反TGTAGTCATTGCCACTTGACCTG；fliC-α 引物序列正CCTTCGGCTACATTAAGCACTAC，反GACTGCACCATCATCAGCAACAT；fliCl引物序列
正CTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTC，反CAATCGTAGTATCGGCATATCCTGT；rfbj引物序列正AGACACTTTGATGAAATTGGGCATT，反TCTTTCAAACTTACCCCAGCACC；fliC2引物序列正CGATACTGCTGTAGCTGCTTCCT，反GCGGCAACAGTGACTTCATAGGT；invA引物序列正CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGA，反CGTTACCCAGAAATACTGACTGCTAC；hiIA引物序列正AACTTACTTTCGCCCATTTCTGC，反GTTATTTCCTGCGTGGATATTTCTT。本发明是用于检测七种常见沙门氏菌血清型甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒 沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠道沙 门氏菌。本发明采用沙门氏菌属高度特异性侵袭基因invA、hilA作为通用靶基因，针对沙 门氏菌多个血清型采用抗原编码基因viaB、tyv、fIiC-α、fliCl、rfbJ、fliC2作为分型靶 基因，共八个靶基因:viaB, tyv、fliC-a、fliCl、rfbj、fliC2、invA、hilA，再根据八个靶基 因设计相应的引物和探针，构建复合基因芯片；本发明使用生物素标记引物，再将引物以 PCR(聚合酶链反应)方法来扩增被检测物质的靶基因片段，扩增产物与基因芯片上的探针 杂交，通过引物和探针双重特异性检测，复合物在芯片表面沉积，使特定的分子杂交转变成 可视信号，从而鉴定沙门氏菌血清型。本发明采用的硅基生物传感器基因芯片集纳米材料、 生物传感器技术、原位放大技术于一体。本发明提供的复合基因芯片及检测方法对沙门氏菌血清型的检测通量高、特异性 强、灵敏度好、快速有效。
图1基因芯片阵列示意图；图2甲型副伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从 上到下分别为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；1 :tyv ；2 :fliC_a ；3 :invA ； 4 :hilA ；)图3乙型副伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从 上到下分别为 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；1 :rfbj ；2 :invA ；3 :hilA ；)图4鼠伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从上 到下分别为 2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,IOObp) ；1:fliCl ；2 :rfbj ；3 :invA ；4 hilA ；)图5丙型副伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从 上到下分别为 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；1 :viaB ；2 :fliC2 ；3 :invA ；4 hilA ；)
图6猪伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从上到 下分别为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；1 :fliC2 ；2 :invA ；3 :hilA ；)图7伤寒沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从上到下 分别为 2000bp, 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp) ；1 :viaB ；2 :tyv ；3 ηνΑ ；4 :hilA ；)图8肠道沙门氏菌靶基因扩增电泳图；(M =DNA Marker DL2000 (分子量从上到下 分别为 2000bp, 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp) ；1 :tyv ；2 ηνΑ ；3 :hilA ；)图9甲型副伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图10乙型副伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图11鼠伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图12丙型副伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图13猪伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图14伤寒沙门氏菌芯片杂交图；图15肠道沙门氏菌芯片杂交图。
具体实施方式在具体实施方式
中，所提到的BW、TMB、洗液A、洗液B、显色液及所使用的仪器是取 自珠海赛乐奇生物科技有限公司的生物传感器基因芯片系统。一、靶基因探针和引物的设计根据上述七种沙门氏菌血清型基因组的异同，选用了 viaB、tyv、fIiC-α、fliCU rfbJ、fliC2、invA、hilA共八个靶基因，七种沙门氏菌血清型与八个靶基因的对应关系如表 一；然后，根据八个靶基因分别设计相应的引物及探针，引物及探针的相关信息详见表二， 靶基因的相关信息见表三。表一沙门氏菌血清型与靶基因对应关系
权利要求
一种检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片，其特征在于，将用于检测沙门氏菌血清型的靶基因viaB、tyv、fliC α、fliC1、rfbJ、fliC2、invA、hilA的探针整合于同一张芯片上，其中各靶基因的探针序列分别为TTCAGAATTA ACCGTAAGGA TATAGTAAAG ATGAAATATT；AGTTTGTACA TGGTGATATT CGCAACAAAA ATGATGTTAC；ATACTGGTTC AATTAAGGAT GGTAAGGTTT ACTATAACAG；ACTCTCAGAC CCTGGGTCTG GATACGCTGA ATGTGCAACA；TTGCGTGAAA TGTACAACAG GCGAACAGAT AAGAGACTTT；TTACGCGACT GTCAGTGGAT ACGATGATGC CGCAGATACA；TGTCCTTTGG TATTAATCCA ACAATCCATC AGCAAGGTAG；GGCGATGAAT TACGCTCACA ACACCTGCAG GATAATCCAA。
2.根据权利要求1所述基因芯片，其特征在于，所述芯片采用硅基生物传感器芯片。
3.—种检测沙门氏菌血清型的方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取被检测物质的染色体DNA；2)使用生物标记素标记引物；3)使用上述被标记的引物以聚合酶链反应方法来扩增所述染色体DNA中包含靶基因 viaB或tyv或fliC- α或fliCl或rfbj或liC2或invA或hilA的基因片段；4)将上述扩增产物与权利要求1所述的复合基因芯片进行杂交；5)检测复合基因芯片的杂交信号。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的引物为与靶基因viaB、 tyv、fliC-α、fliCl、rfbj、fliC2、invA、hilA分别相应的八种引物，其中八种引物序列分 别为viaB引物序列正GCGGCAACATCAGTCCAG，反GCGGCTCACGTACTCCAAAT ； tyv引物序列正GCTTCCTTGGGAGTAATCTTGCC，反TGTAGTCATTGCCACTTGACCTG ； fliC-α引物序列正CCTTCGGCTACATTAAGCACTAC，反GACTGCACCATCATCAGCAACAT ； fliCl引物序列 正CTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTC， 反:CAATCGTAGTATCGGCATATCCTGT ； rfbj引物序列正AGACACTTTGATGAAATTGGGCATT， 反:TCTTTCAAACTTACCCCAGCACC ； fliC2引物序列 正CGATACTGCTGTAGCTGCTTCCT， 反:GCGGCAACAGTGACTTCATAGGT ； invA引物序列正CGTTGATATTACTTGTGCCGAAGA，反:CGTTACCCAGAAATACTGACTGCTAC ； hiIA引物序列正AACTTACTTTCGCCCATTTCTGC，反GTTATTTCCTGCGTGGATATTTCTT。
全文摘要
本发明涉及一种检测沙门氏菌血清型的复合基因芯片，将沙门氏菌血清型检测靶基因viaB、tyv、fliC-α、fliC1、rfbJ、fliC2、invA、hilA的探针整合于同一张芯片上，可鉴定甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌。本发明可快速、准确进行沙门氏菌属及其血清型初筛鉴定，大大缩短检验时间，适应高通量检测的要求。
文档编号C12Q1/68GK101955993SQ20101020133
公开日2011年1月26日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日 公开号201010201331.发明者冯家望, 周新朋, 成晓维, 游淑珠, 王小玉, 胡松楠, 邝筱珊 申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局