专利名称：ABA8'-羟化酶基因的RNAi植物表达载体及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种抑制ABA8’ -羟化酶基因表达的 RNAi植物表达载体及其用途，特别涉及基于大麦ABA8’ -羟化酶基因HvABAS’ OH-I的双链 RNAi植物表达载体及其在抗穗发芽基因工程中的用途。
背景技术：
穗发芽(Pre-harvest sprouting, PHS)或穗萌是指籽粒收获前遇到阴雨天气或 潮湿环境下的穗上发芽。穗发芽时常发生于小麦、大麦、玉米和水稻等主要农作物，严重 影响其产量和品质，是世界性重要农业灾害。穗发芽受环境和基因型互作的控制(Zhang HF, Lu RH. Study on the mechanism of the resistance to preharvest sprouting and inheritancein wheat. Acta Agron Sin，1993，19 (6) :523_530)，基因型影响穗发芽的因素 极其复杂(Sheng ZXjYu SRjWu ZS. Studies on pre-harvest sprouting resistance in wheatcultivars. Sci Agic Sin，1991，24 (5) :44_50;肖世和.小麦穗发芽研究.中国北 京.中国农业出版社，2003)，目前已发现穗发芽性状受多个遗传系统的调控，种子休眠性 弱以及随后产生的高？淀粉酶活性是导致籽粒穗发芽的主要原因(Biddulph TB，Plummer JA, Setter TL, Mares DJ. Influence of high temperature and terminal moisture stresson dormancy in wheat(Triticum aestivum L.). Field Crops Res，2007，103 139-153)。尽管目前已发现多个与休眠有关的QTL位点，其遗传效应在很大程度上受到环 境或其他基因互作的影响，难以有效用于育种实践。抗性资源匮乏是作物抗穗发芽育种急 需解决的关键问题。脱落酸(ABA)是诱导和维持种子胚休眠并抑制萌发的重要植物激素(Gubler F, MillarAA, Jacobsen JV. Dormancy release, ABA and pre—harvest sprouting. Curr OpinPlant Biol,2005,8 183-187 ；Lefebvre V, North H, Frey A, Sotta B, Seo M, Okamoto M, Nambara E, Marion—Poll A. Functional analysis of Arabidopsis NCED6and NCED9 genes indicates that ABA synthesized in the endosperm is involved inthe induction of seed dormancy. Plant J, 2006，45 :309_319)，最新研究表明，ABA 合成关 键酶基因的突变导致水稻种子ABA含量下降并发生穗萌(Fang J, Chai CL, Qian Q，Chu CC, Li CL, Tang JY, Sun L, Huang ZJ, Guo XL, Sun CH, Liu M. Mutations ofgenes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvestsprouting and photo-oxidation in rice. Plant J，2008，54 :177-189)。ABA 合成与分解代谢的动态平衡 共同调控植物内源ABA水平，ABA 8’-羟化酶(ABA 8’_hydroxylation)是内源ABA主要代 谢途径的关键酶。研究表明，属于细胞色素P450家族的ABA8’-羟化酶基因CYP707A与拟南 芥种子萌发过程中ABA的迅速下降有着密切的联系，其中CYP707A2被认为是调控种子ABA 水平，进而影响种子从休眠向萌发状态转化的重要基因。目前已先后从水稻(Yang SH,Choi D. Characterization of genes encoding ABA -hydroxylase inethylene-induced stem growth of deepwater rice (Oryza sativa L. ). Biochem&Biophys Res Commun,2006，350 :685_690)、大麦(Millar AA, Jacobsen JV, Ross JJ, Helliwell CA, Poole AT, Scofield G, Reid JB, Gubler F. Seed dormancy and ABAmetabolism in Arabidopsis and barley :The role of ABA 8' -hydroxylase. Plant J, 2006,45 (6) :942_954)、小麦 (Zhang CL,He XY,He ZH,Wang LH,Xia XC. Cloningof TaCYP707Al gene that encodes ABA 8' -hydroxylase in common wheat(Triticumaestivum L.).Sci Agic Sin,2009,8 (8) 902-909)等物种中克隆到CYP707A2同源基因。大麦同源基因HvABA8，0H_1 (gi =81362265) 基因表达谱分析表明，种子吸胀过程中该基因表达量在不休眠种子中明显高于休眠种子， 与这一时期种子中ABA含量的明显下降相对应，说明HvABAS’ 0H-1可能是种子萌发过程中 的一个关键基因(Millar AA, Jacobsen JV, RossJJ, Helliwell CA, Poole AT, Scofield G, Reid JB,Gubler F. Seed dormancy and ABAmetabolism in Arabidopsis and barley :The role of ABA 8'-hydroxylase. Plant J，2006，45 (6) :942_954)。基因序列比对发现，位于 大麦同源基因HvABA8’ 0H-1编码区1006_1298bp的片段比较保守，在不同物种中相似性平 均达到80%左右，与水稻同源基因0SCYP707A5的相似性高达93%。RNA干扰(RNAi)是指转基因植物中双链RNA诱导同源mRNA降解，导致特定基 因不表达或表达量很低的现象。随着植物基因组测序工作的完成，以及越来越多生物代 谢途径中某些关键酶基因的发现，RNAi技术已成为动植物性状改良和疾病基因治疗的强 有力工具(Wang MB, Abbott DC, Waterhouse PM. A single copy of a virus-derived transgene encodinghairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus. Mol Plant Pathol,2000,1(6) 347-356 ；Regina A, Bird A, Topping D, Bowden S, Freeman J, Barsby T,Kosar-Hashemi B,Li ZY, Rahman S,Morell M. High-amylose wheat generated by RNAinterference improves indices of large-bowel health in rats. PNAS,2006, 103 =3546-3551)。选择控制内源ABA主要代谢途径的ABA 8，-羟化酶基因序列，设计构建 高效的RNAi植物表达载体用于转化植物组织细胞，通过特异性抑制内源ABA代谢相关的酶 基因表达来提高种子内源ABA含量，增强种子胚休眠水平从而抑制穗发芽，有可能从根本 上控制作物穗发芽的危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物ABA代谢途径中的关键酶基因的双链RNAi植物表 达载体及其用途。本发明提供的RNAi植物表达载体含有来源于大麦ABA 8’-羟化酶基因 (ΗνΑΒΑ8 Η-1)碱基序列的发卡RNA(hpRNA)表达盒和选择标记基因表达盒。hpRNA表达盒 含有pGlub种子特异性启动子驱动的ABA 8'-羟化酶基因反向重复序列片段，是来自序列 表1的5'端第1 006位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3'端延长，长度为 293bp的脱氧核苷酸片段，在植物细胞内能转录形成发卡结构的双链RNA。选择标记基因表 达盒含有PNos启动子、潮霉素抗性基因hpt和Nos终止子。上述hpRNA表达盒以及含有它的重组表达载体，包括构建的中间载体和具选择标 记基因的RNAi表达载体，工程菌均属于本发明的保护范围。本发明的RNAi植物表达载体通过使用Ti质粒、直接DNA转化、微注射、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，在转化细胞内能转录形成hpRNA双链RNA分子。经种子特异表达的hpRNA诱导产生的RNAi能抑制ABA 8’ -羟化酶基因表达，降低转化植 株的ABA代谢水平，使内源ABA含量维持在一定水平，从而增强种子休眠性和抗穗发芽能 力。使用本发明的载体转化水稻愈伤组织获得18个转基因水稻株系，种子萌发实验的结果 初步表明，部分转基因水稻株系的种子萌发速率明显降低。引发RNAi的效应分子是长度仅 为21-23bp的双链RNA(dsRNA)，用于构建本载体的大麦HvABA8’ OH-I基因片段与水稻、小 麦同源基因的相似性高达93%以上，载体可以形成长度为293bp的dsRNA。因此该载体可 以转化小麦、大麦、水稻等重要禾本科作物，在培育抗穗发芽转基因作物新品种领域具有很 好的应用前景。
图1为HvABA8 iOH-I基因片段RNAi载体的构建流程 2 为 HvABA8 iOH-I 基因片段 RNAi 载体分别经 EcoR I/PstI 和 Spel/BamH I 双 酶切的电泳图。图中1为未酶切的重组质粒，2为酶切的重组质粒，M为DL2000 Maker，A为 HvABAS' OH-I基因片段酶切图，B为内含子酶切图。图3为PABA8，OH-I载体的质粒图谱。图4为转基因水稻的PCR鉴定。M为DL2000 Maker，1为质粒阳性对照，2为未转 化植株阴性对照，3、4、6、7、8、10均为转基因植株，5和9为转基因阴性植株。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成菌株和质粒作为骨架载体的克隆载体pGreenll具有潮霉素抗性基因。质粒PBI121、质粒 PBIlOl和质粒PTCK303分别提供构建载体需要的pGlub胚乳特异性启动子、NOS终止子和 内含子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为 DH5a，农杆菌(Agrobacterim tumefacieus) 菌株为AGLl。PCR引物序列启动子采用来自质粒PBI121的胚乳特异性启动子pGlub，设计含有SacI和NotI 酶切位点的上下游引物PgluB-FP :5’ AAGGAGCTCAGCTAGTATAGCTATCTAGGGTG 3’PgluB-RP :5，AAGGCGGCCGCTAGCGGTGGCGTTTGGGTGG 3，。以质粒PBIlOl为模板，扩增Nos终止子，设计含有KpnI和XhoI酶切位点引物Nos-FP :5，AAGCTCGAGGATCGTTCAAACATTTGG 3，Nos-RP :5，AAGGGTACCGTAACATAGATGACACCG 3，。以质粒PTCK303为模板扩增内含子，分别携带SpeI和BamH I酶切位点引物Intron-FP :5’ AAGACTAGTAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC 3’Intron-RP :5，AAGGGATCCCTGAAAATCTCGAAACAGCC 3，。以大麦RNA反转录第一链cDNA为模板，扩增HvABAS’ OH-I基因片段，设计正向引 物所带酶切位点为XbaI和NotI，反向引物所带酶切位点为EcoR I和PstI。
OHlCF :5’ TTGTCTAGAGCGGCCGCCGGGTGATCCAGGAGACGAT 3’OHlCR :5’ TTGACTAGTCTGCAGAGGTGGTGGCAGAGGACGAG 3’实施例2 RNAi植物表达载体的构建及转化启动子，终止子与内含子的PCR扩增以质粒载体PBI121、PBI101和PTCK303为模板，分别用携带相应酶切位点的上、下 游引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，得到的特异性片段大小分别为1200、250、500bp 左右，与预期目的片段大小一致。HvABA8 ‘0H-1 基因片段的 RT-PCR 扩增以大麦cDNA为模板进行PCR扩增。扩增出293bp与预期大小相符的基因片段，经 测序验证片段序列正确。HvABA8 ‘0H-1基因片段RNAi载体的构建克隆骨架载体采用携带潮霉素抗性选择标记基因(hpt)的双元载体pGreenll。根 据酶切位点，连接的先后顺序为=PGlub启动子、Nos终止子、HvABAS’ OH-I基因反向片段和 HvABAS Η-1基因的正向片段，最后将内含子连接上(图1)。各元件经琼脂糖凝胶纯化后， 连接进克隆载体pGreenll，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，重组质粒经酶切，与 目的片段大小吻合(图2)，并将重组子送奥科生物公司测序验证正确。将构建正确的包含 HvABA8’ OH-I基因片段的RNAi载体命名为pABA8’ OH-I。4.农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定采用电击法将载体质粒导入农杆菌AGL1，并用来转化420粒粳稻品种‘日本晴’成 熟种子胚愈伤组织，获得再生植株52株，移栽成活50株。以总DNA为模板，通过PCR鉴定 转基因植株中的潮霉素抗性基因，结果表明8株为水稻阳性植株。种子萌发实验通过转基因水稻Fl种子的发芽试验，筛选获得4个发芽率明显低于对照的转基因 水稻株系，初步表明通过人工构建载体诱导的RNAi来增强种子胚休眠性，从而提高种子抗 穗发芽能力是有可能实现的。序列表1 :HvABA8，OH-I基因全序列ATGGGTGCCTTCATCCTCCTCCTCTGCTTGCTCGTGCCGTTGGTGCTCGTGTGCGCCGTCCGCGCCAGG AAGGGCGCCGGCGGGCGGTCGTCGTCGGGCGGCGGCAAGAAGGGCAGGCTGCCGCCGGGGTCCATGGGGTGGCCGTA CGTGGGCGAGACCACGCAGCTCTACTCCTCCAAGAACCCCAACGTCTTCTTCGCCAGGAAGCGTAACAAGTACGGGC CCATCTTCAAGACGCACATCCTCGGGTGCCCCTGCGTCATGGTGTCCAGCCCGGAGGCCGCCAAGTTCGTGCTCGTC ACGCAGGCGCACCTCTTCAAGCCTACCTTCCCGGCCAGCAAGGAGCGGATGCTGGGCCGCCAGGCCATCTTCTTCCA GCAGGGGGACTACCACACCCACCTCCGCCGTCTCGTCTCCCGCGCCTTCTCCCCCGAGGCCATCCGCGGCTCCGTTT CCTCCATCGAGGCCATCGCCCTCCGCTCCCTCGGCTCATGGGAAGGCCATGAAGTCAACACCTTCCAAGAAATGAAG ACTTACGCTCTGAATGTGGCATTGCTGTCCATCTTCGGGGAGGAGGAGATGCAGTACATCGAGGAGCTGAAGCAGTG CTACCTGACGCTGGAGAAGGGGTACAACTCGATGCCGGTGAACCTGCCGGGCACGCTGTTCCACAAGGCCATGAAGG CCCGGAAGCGGCTGGGCGCCATTGTGGCCCACATCATCTCAGCCCGGCGCGAGCGGGAGCGCGGGAGCGACCTCCTG GGCTCCTTCATGGACGGCCGCGAGGCGCTCACCGACGACCAGATCGCCGACAACGCCATCGGCGTCATCTTCGCCGC GCGGGACACCACCGCCAGCGTGCTCACGTGGATGGTCAAGTTCCTCGGCGACAACCCCGCCGTCCTCAAAGCCGTCA CCGAAGAGCACGCCGAGATCGCGAGGGAGAAGGCGTTGTCCGGCGAGCCGCTGTCGTGGGCCGACACGCGGCGGATGCGGGTGACGGGCCGGGTGATCCAGGAGACGATGCGGGTGGCGTCCATCCTCTCCTTCACCTTCAGAGAGGCCGTCGA GGACGTGGAGTACCAAGGGTACCTGATCCCCAAGGGCTGGAAAGTGCTTCCCCTGTTCCGGAACATCCACCACAACC CCGACCACTTCCCCTCCCCCGAAAAGTTCGATCCTTCACGATTCGAGGTGGCCCCCAAGCCCAACACGTTCATGCCG TTCGGGAACGGGACCCACTCGTGCCCCGGCAACGAGCTGGCCAAGCTGGAGATGCTCGTCCTCTGCCACCACCTCGC CACCAAGTACAGATGGTCTACCTCCAAGTCCGAGAGCGGCGTGCAGTTCGGCCCCTTCGCCCTGCCCATCAACGGCC TCCCCATGACCTTCACCCGCAAGGCCTGASEQUENCE LISTING<110>中国科学院成都生物研究所<120>ABA8’羟化酶基因的RNAi植物表达载体及用途<130> 说明书<160>9<170> PatentIn version 3. 3<210>1<211>32<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>1aaggagctca gctagtatag ctatctaggg tg 32<210>2<211>31<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>2aaggcggccg ctagcggtgg cgtttgggtg g 31<210>3<211>27<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>3aagctcgagg atcgttcaaa catttgg27<210>4<211>27<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>4aagggtaccg taacatagat gacaccg27<210>5<211>31<212>DNA<213>Hordeum bogdanii0076
0077
0078
0079
0080 0081 0082
0083
0084
0085
0086
0087
0088
0089
0090
0091
0092
0093
0094
0095
0096
0097
0098
0099
0100
<400>5
aagactagta gatctgctag cggtaagtta c <210>6 <211>29 <212>DNA
<213>Hordeum bogdanii <400>6
aagggatccc tgaaaatctc gaaacagcc
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>Hordeum bogdanii <400>7
ttgtctagag cggccgccgg gtgatccagg agacgat
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>Hordeum bogdanii <400>8
ttgactagtc tgcagaggtg gtggcagagg acgag
<210>9
<211>1407
<212>DNA
<213>Hordeum bogdanii <400>9
31
29
37
35
0101]atgggtgccttcatcctcctcctctgcttgctcgtgccgttggtgctcgtgtgcgccgtc600102]cgcgccaggaagggcgccggcgggcggtcgtcgtcgggcggcggcaagaagggcaggctg1200103]CCgCCggggtccatggggtggccgtacgtgggcgagaccacgcagctctactcctccaag1800104]aaccccaacgtcttcttcgccaggaagcgtaacaagtacgggcccatcttcaagacgcac2400105]atcctcgggtgcccctgcgtcatggtgtccagcccggaggccgccaagttcgtgctcgtc3000106]acgcaggcgcacctcttcaagcctaccttcccggccagcaaggagcggatgctgggccgc3600107]caggccatcttcttccagcagggggactaccacacccacctccgccgtctcgtctcccgc4200108]gccttctcccccgaggccatccgcggctccgtttcctccatcgaggccatcgccctccgc4800109]tccctcggctcatgggaaggccatgaagtcaacaccttccaagaaatgaagacttacgct5400110]ctgaatgtggcattgctgtccatcttcggggaggaggagatgcagtacatcgaggagctg6000111]aagcagtgctacctgacgctggagaaggggtacaactcgatgccggtgaacctgccgggc6600112]acgctgttccacaaggccatgaaggcccggaagcggctgggcgccattgtggcccacatc7200113]atctcagcccggcgcgagcgggagcgcgggagcgacctcctgggctccttcatggacggc7800114]cgcgaggcgctcaccgacga ccagatcgccgacaacgccatcggcgtcatcttcgccgcg840
8
cgggacaccaccgccagcgtgctcacgtggatggtcaagt tcctcggcgacaaccccgcc900
gtcctcaaag ccgtcaccga agagcacgccgagatcgcga gggagaaggcgttgtccggc960
gagccgctgtcgtgggccga cacgcggcggatgcgggtga cgggccgggtgatccaggag1020
acgatgcggg tggcgtccatcctctccttcaccttcagag aggccgtcgaggacgtggag1080
taccaagggtacctgatccccaagggctggaaagtgcttc ccctgttccggaacatccac1140
cacaaccccgaccacttcccctcccccgaaaagttcgatc cttcacgattcgaggtggcc1200
cccaagcccaacacgttcatgccgttcgggaacgggaccc actcgtgccccggcaacgag1260
ctggccaagctggagatgctcgtcctctgccaccacctcg ccaccaagtacagatggtct1320
acctccaagtccgagagcggcgtgcagttcggccccttcg ccctgcccatcaacggcctc1380
cccatgaccttcacccgcaaggcctga140权利要求
一种基于大麦ABA 8’-羟化酶基因HvABA8’OH-1序列的发卡RNA表达盒，其特征在于含有来自序列表1的5′端第1006位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延长，长度为293bp的反向重复脱氧核苷酸片段。
2.一种大麦ABA 8’ -羟化酶基因的RNAi植物表达载体，包括抗生素抗性选择标记基 因，其特征在于含有权利要求1所述的大麦ABA 8’ -羟化酶基因的发卡RNA表达盒。
3.根据权利要求2所述的一种大麦ABA8’ -羟化酶基因的RNAi植物表达载体，其特 征在于所述的抗生素抗性选择标记基因为潮霉素抗性基因hpt。
4.根据权利要求1或2或3所述的大麦ABA8，-羟化酶基因的RNAi植物表达载体， 其特征在于所述载体能在转化细胞内转录形成发卡RNA结构的双链RNA分子，诱导转化细 胞产生RNAi。
5.含有权利要求1所述大麦ABA8’-羟化酶基因的发卡RNA表达盒的重组表达载体、 工程菌或转基因细胞系。
6.权利要求1所述的大麦ABA8’ -羟化酶基因的发卡RNA表达盒在培育抗穗发芽植 物中的用途。
7.权利要求2或3或5所述的大麦ABA8，-羟化酶基因的发卡RNA表达盒在培育抗 穗发芽植物中的用途。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种基于大麦ABA 8′-羟化酶基因(HvABA8 OH-1)序列的发卡RNA表达盒、RNAi植物表达载体及其应用。本发明大麦ABA 8′-羟化酶基因的发卡RNA表达盒、RNAi植物表达载体含有来自序列表1的5′端第1006位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延长，长度为293bp的反向重复脱氧核苷酸片段，能在转化细胞内转录形成发卡RNA结构的双链RNA分子，诱导转化细胞产生RNAi降低内源ABA代谢水平，从而增强转基因植物种子休眠性。本发明的载体在培育抗穗发芽转基因作物新品种方面具有很好的应用前景。
文档编号C12N1/00GK101880667SQ201010301188
公开日2010年11月10日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者刘春明, 郑寒, 陈静 申请人:中国科学院成都生物研究所