专利名称：沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测试剂与使用方法，具体涉及一种沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试
剂紐其使用方法。
背景技术：
沙门氏菌是^^源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌造成的 食物中毒位居前列。它主要是通过食品，特别是动物性食品，比如，蛋、奶以及肉制品等进行传 播，引起人类肠胃疾病。沙门氏菌日益威胁着人类的健康，因此，需要建立一种安全可靠、简便 快速的检测方法来保证食品的安全。常规的沙门氏菌检测方法包括细菌的增殖培养、生化鉴定和
血清学鉴定， 一般需要4 6天的时间才能完成，不仅费时而且费力，己经不能满足食品生产的控 制要求。
近年来，有大量的J隨证实基于PCR的方法己经成功用于检测沙门氏菌，PCR方法在操作时 间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度 循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4 8h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从 而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法， 在一定禾號上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核, 列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。 ^H种方法的检测水平都 不少于10个拷贝，耗时lh左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标 序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技 术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅 助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal ampl迅cationofDNA,， LAMP)克服 以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多 的tfc^性，见文献Notomi T, Okayama H， Masubuchi H, Yonekawa T， Watanabe K Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.。该方法 通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA; 步骤二特异性弓嫩的制备确定待测标本的耙基因后，取得特异性引物2沐内引物和外引物 各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、引物、反应缓冲 液与BWDNA聚合酶混合，在63 651:保温0.5至1.511进行循环艘换反应；步骤四、分析判断 反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温^f牛下高效地扩增核酸，但是 现有技术也有不足之处，主要是1.特殊弓l物要求极为苛亥鹏制该方法的广泛应用；2.需要对细
胞或组织破碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；3.为了 满足扩增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；4.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果， 不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的 LAMP技术进行舰。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种沙门氏菌原位荧光介导快速检测试剂盒及其 检测方法。该方、，异性强、灵敏度高、检准率高、鉴定简便。 为达到本发明的目的，采用以下技术方案-
本发明的一种沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒，其试剂包括- 引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/^d，引物序列如下
外引物l: GTTCAACAGCTGCGTCATGA;
夕卜弓|物2: CGCTATTGCCGGCATCATTA;
内引物1: CCCAG--ATCCCCGCAlTGTTGAnTTTCCGCCCCATATTATCGCTAT;
内引物2: Cy3"GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG; ②Rs/DNA聚合酶浓度为8U4U; (D蛋白酶K:浓度为0.1-0.2ng/ml; ④RNA酶浓度为0.4-0.6mg/ml;
溶菌酶溶液0.5mg/ml溶菌酶，pH 8.0-9.0、 100mMTris-HCl， 50mMEDTA; LAMP反应缓冲液10mMdNTP:10xTheimoPol反应缓冲液150mMMgSO4:5mM Betina:8:5:2:10体积；
⑦ 磷酸缓冲液；
⑧ M性处理试剂l:为3-5%质量多聚甲醛；
ilii性处理试剂2:为0.02-0.04%质量多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为30-60%体积乙醇、60-90%体积乙醇、90-100%体积乙醇;
(Q)复染剂荧光染料l-2mg/mlDAPI;
阳性对照为猪霍舌L沙门氏菌基因组DNA。
所述的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04
用上述试齐IJ盒检测沙门氏菌的方法包括以下步骤
(1) 被检样品的菌体固定处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；上清 液依次做10倍稀释度稀释，針稀释度取0.5-5ml涂平鹏亍细胞计数；离心，沉淀 上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次，加入3-5%质量多聚甲醛固定；细胞 悬浮液10-100pl滴加到用0.02-0.04%质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全 柜中自然风干；
(2) 被检样品的细胞壁iM性处理将固定好的细胞分别置于30-60%, 60-90%， 90-100%
体积乙醇液中各处理l-2min，进行脱水；用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细 胞10min，达到部分降解细胞壁的目的;用0.1-0.2pg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min^ 去除细胞壁以及与DNA结合的蛋白；最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理15-25min,除 掉细胞中的RNA，减少对DNA扩增的影响；
(3) 环介导等温扩增反应在50-200|alPCR管配置反应体系，加入2-20pl引物混合液，LAMP 反应缓冲液6.25-62.5^1， B对DNA聚合酶0.5-5^1，加水至12.5-125|al;将配置好的反应 混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应l-2h; 所用阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA;
(4) 样品复染反应结束后，将玻片置于l-2mg/ml DAPI染料中染色10-12min，然后在无菌 水中漂洗，自然干；
(5) 分析判断反应产物结果将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开绿色光， 在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准；反之，紫 夕卜光下可以看到而绿色光激发下看不至啲细胞即为阴性结果，在荧光显微镜下最低可以 检测到l个细胞，未发现假阳性。
步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65X:范围。 步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为13-20h。
步骤(1)所述的离心取上清液的^^I为1000-2000rpm，时间为l-2min。
步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的,为10000-15000rpm，时间为24min。
步骤(4)所述的漂洗次数为2次以上，皿2次，时间为每次12-15min。
本发明的一种沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒及其检测方法有以下优点
1、 高特异性本发明根据沙门氏菌/m^基因保守区设计了四斜寺异性引物 外引物l: GTTCAACAGCTGCGTCATGA;
外引物2: CGCTATTGCCGGCATCATTA;
内弓l物1: CCCAGATCCCCGCATTGTTGATmrCCGCCCCATATTATCGCTAT;
内引物2: Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTAnTCGGTGGG;
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断耙标物质的存在与否，阳性率可达大于99%， 假阳性率小于1%;
2、 无需增菌检测之前不需要对待检菌进行培养；
3、 实现样品原位检测在不增菌的条件下，直接对样本中的病原菌微生物进行原位基因扩增;
4、 快速、高效扩增扩增在不到2h即可完成，且产率高；
5、 灵鹏高在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到10CFU/ml， 标本的检出率达到99%;
6、鉴定简便通过荧光显微镜观察细胞是否发荧光进行鉴定，无需电泳等其他ffi^分析步骤。
具体实 式 实施例l
按下列配方配置沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒 引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol4J，引物序列如下
外引物l: GTTCAACAGCTGCGTCATGA;
外引物2: CGCTATTGCCGGCATCATTA;
内弓l物1: CCCAGATCCCCGCATTGTTGATTTTTCCGCCCCATATTATCGCTAT;
内引物2: Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG;
B^DNA聚合酶浓度为8U4il;
蛋白酶K:浓度为0.1^lg/ml;
RNA酶浓度为0.4mg/ml;
溶菌酶溶液0.5mg/ml溶菌酶，pH8.0、 100mMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反应缓冲液80^11 OmMdNTP， 50^11 OxThermoPol反应缓冲液，20^1150mMMgSO4， 100|j1 5mMBetina;
磷酸缓冲液137mMNaC1, 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性处理试剂1:为3%质量多聚甲醛；
ffl3S性处理试剂2:为0.02°/。质量多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为30%体积乙醇、60%体积乙醇、90%体积乙醇；
复染剂荧光染料lmg/mlDAPI;
阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对沙门氏菌进行检测
1、 被检样品的菌体固定处理(1)将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取0.51111细胞悬浮液 于离心管中，1000rpm离心2min，取上清液；(2)上清液依次做10倍稀释度稀释， 稀释度取0.5ml涂平板进行细胞计数(3) 15000rpm离心2min沉淀上清中的细胞，然后 用磷酸缓冲液冲洗细胞三次，加lml 3%质量多聚甲醛固定20h; (4)细脱悬浮液lOpl滴 加到用0.02°/。质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。
2、 被检样品的细胞壁ffl3S性处理(1)将固定好的细胞分别置于30%, 60%， 90%体积的乙 醇溶液中各处理2min，进行脱水；(2)用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞 10min; (3)用0.1ng/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min; (4)用0.4mg/ml的RNA酶处 理25miru
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应(1)在50plPCR管配置反应体系加入2pl引物混合液，LAMP反应缓冲液6.25μl， 8对0\八聚合酶0.5μl，加水至12.5μl; (2)将配置好的反应混 合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；(3)置于63'C恒温反应2h。
4、 样品复染反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色12min，然后在无菌水中漂 洗两次，每次12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开纟絶光， 在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果(细胞形态以阳性对照为准)，反之，紫 夕卜光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
实施例2
按下列配方配置沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒 弓嫩混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下
外引物l: GTTCAACAGCTGCGTCATGA;
外引物2: CGCTATTGCCGGCATCATTA;
内弓l物1: CCCAGATCCCCGCATTGTTGATmTCCGCCCCATATTATCGCTAT;
内引物2: Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG;
B对DNA聚合酶浓度为8U/μl;
蛋白酶K:浓度为0.1μg/ml;
RNA酶浓度为0.5mg/ml;
溶菌酶溶液0.5mg/ml溶菌酶，pH8.2、 100mMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反应缓冲液80μl 10mMdNTP， 501 lOxThermoPol反应缓冲液，150mM
MgS04， 10015mMBetina; 磷酸缓冲液137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
通透性处理试剂l:为4%质量多聚甲醛；
通透性处理试剂2:为0.03%质量多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液50%体积乙醇、80%体积乙醇、100%体积乙醇；
复染剂荧光染料lmg/mlDAPI;
阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对沙门氏菌进行检测
1、 被检样品的菌体固定处理(1)将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取lml细胤悬浮液于 离心管中，1000rpm离心2min，取上清；(2)上清液依次做10倍稀释度稀释，針稀释 度取lml涂平板进行细胞计数；(3) 12000rpm离心3min沉淀上清中的细胞，然后用磷 酸缓冲液冲洗细胞三次，加 lml 4%质量多聚甲醛固定16h; (4)细胞悬浮液20nl滴加到 用0.03%质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板 L中，生物安全柜中自然风干。
2、 被检样品的细胞壁M性处理(1)将固定好的细胞分别置于50%， 80%, 100%体积乙醇 溶液中各处理lmin，进行脱水；(2)用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10min;
(3 )用0.1 ng/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min; (4)用0.5mg/ml的RNA酶处理20min。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应(1)在50pIPCR管配置反应体系加入4pl引物混合液， LAMP反应缓冲液12.5pl， BwDNA聚合酶lpl (8U)，加水至25^1; (2)将配置好的反应 混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；(3)置于63匸恒温反应2h。
4、 样品复染反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色12min，然后在无菌水中漂 洗两次，每次12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开纟tfe光， 在丰鹏中看到激发红色荧光的细胞(细胞形态以阳性对照为准)就是阳性结果，反之，紫 外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
实施例3
按下列配方配置沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒
弓l物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmd4il，引物序列如下
外引物l: GTTCAACAGCTGCGTCATGA; 外引物2: CGCTATTGCCGGCATCATTA;
内引物1: CCCAGATCCCCGCAITGTTGATTTTTCCGCCCCATATTATCGCTAT;
内引物2: Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATITCGGTGGG;
BWDNA聚合酶浓度为8U/Ml;
蛋白酶K:浓度为0.2pg/ml;
RNA酶浓度为0.6mg/ml;
溶菌酶溶液0.5mg/ml溶菌酶，pH9.0、 lOOmMTris-HCl， 50mMEDTA; LAMP反应缓冲液:80^110mM dNTP， 50^110xThermoPo1反应缓冲液，20^1150mM MgS04， 100jil5mM Betina;
磷酸缓冲液137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1raMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性处理试剂h为5%质量多聚甲醛； 通透性处理试剂2:为0.04%质量多 氨酸；
系列浓度乙醇溶液为60%体积乙醇、90%体积乙醇、100%体积乙醇； 复染剂荧光染料2mg/mlDAPI; 阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA。 用上述试剂盒检测沙门氏菌的方法包括以下步骤
1、被检样品的菌体固定处理(1)将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取5ml细胞悬浮液于 离心管中，2000tpm离心lmin，取上清；(2)上清液依次做10倍稀释度稀释，旨稀释 度取5ml涂平板进行细胞计数；(3) 10000ipm离心4min沉淀上清中的细胞，然后用磷 酸缓冲液冲洗细m^次，力口lml5。/。质量多聚甲醛固定13h; (4)细胞悬浮液lOOnl滴加到 用0.04%质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。2、 被检样品的细胞壁3Iit性处理(1)将固定好的细胞分别置于60%， 90%, 100%浓度的乙 醇溶液中各处理lmin，进行脱水；(2)用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞 10min; (3)用0.2pg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2min; (4)用0.6mg/ml的RNA酶处 理15min。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应(1)在200plPCR管配置反应体系加入20nl引物混合 液，LAMP反应缓冲液62.5iLd， BwDNA聚合酶5nl (8U)，加水至125^1; (2)将配置好 的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；(3)置于65。C恒温反应lh。
4、 样品复染反应结束后，将玻片置于2mg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂 洗两次，每次15min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开绿色光， 在冬鹏中看到激发红色荧光的细胞(细胞形态以阳性对照为准)就是阳性结果，反之，紫 外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
权利要求
1、一种沙门氏菌原位荧光环介导快速检测试剂盒，其特征在于，试剂包括①引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下外引物1GTTCAACAGCTGCGTCATGA；外引物2CGCTATTGCCGGCATCATTA；内引物1CCCAGATCCCCGCATTGTTGATTTTTCCGCCCCATATTATCGCTAT；内引物2Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG；②Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl；③蛋白酶K浓度为0.1-0.2μg/ml；④RNA酶浓度为0.4-0.6mg/ml；⑤溶菌酶溶液0.5mg/ml溶菌酶，pH 8.0-9.0、100mMTris-HCl，50mM EDTA；⑥LAMP反应缓冲液10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO4∶5mMBetina＝8∶5∶2∶10体积；⑦磷酸缓冲液；⑧通透性处理试剂1为3-5％质量的多聚甲醛；⑨通透性处理试剂2为0.02-0.04％质量的多聚赖氨酸；⑩系列浓度乙醇溶液为30-60％体积乙醇、60-90％体积乙醇、90-100％体积乙醇； id="icf0001" file="A2008100302640002C1.tif" wi="4" he="4" top= "145" left = "24" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>复染剂荧光染料1-2mg/ml DAPI； id="icf0002" file="A2008100302640002C2.tif" wi="4" he="4" top= "152" left = "24" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04。
3、 权利要求1或2所述的试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 被检样品的菌体固定处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清液；上清液依 次做10倍稀释度稀释，#^稀释度取0.5-51111涂平板进行细胞计数；离心，沉淀上清液中的 细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次，加入3-5%质量多聚甲醛固定；细胞悬浮液10-100μl 滴加到用0.02-0.04%质量多聚赖氨酸处舰的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干；(2) 被检样品的细胞壁Mif性处理将固定好的细胞分别置于30-60%， 60-90%， 9(M00W体积的 乙醇液中各处理l-2min，进行脱水；用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10min; 用0.1-0.2μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min;最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理 15-25min;(3) 环介导等温扩增反应在50-200μlPCR管配置反应体系，加入2-20μl引物混合液，LAMP 反应缓冲液6.25-62.5μ1， BstDNA聚合酶0.5-5μl，加水至12.5-125u1;将配置好的反应混合 液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应l-2h;所用阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA;(4) 样品复染反应结束后，将玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色10-12min，然后在无菌水中 漂洗，自然干；(5) 分析判断反应产物结果将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开绿色光，在 视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准；反之，紫外光下 可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果，在荧光显微镜下最低可以检测到1个 细胞，未发现假阳性。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65X:范围。
5、 根据权禾腰求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为13-20h。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心取上清液的转速为 1000-2000rpm，时间为l-2min。
7、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的,为 画0-15000rpm，时间为2-4min。
8、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)所述的漂洗次数为2次，每次12-15min。
全文摘要
本发明公开了一种沙门氏菌原位荧光介导快速检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括引物混合液，其序列为外引物1GTTCAACAGCTGCGTCATGA；外引物2CGCTATTGCCGGCATCATTA；内引物1CCCAGATCCCCGCATTGTTGATTTTTCCGCCCCATATTATCGCTAT；内引物2Cy3-GACCATCACCAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGG；Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶溶液、LAMP反应缓冲液、磷酸缓冲液、通透性处理试剂、系列浓度乙醇溶液、复染剂、阳性对照。利用该试剂盒通过沙门氏菌菌体固定处理、细胞通透性处理、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对沙门氏菌高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的原位检测。
文档编号C12Q1/10GK101343660SQ20081003026
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者常彦磊, 琳 李, 王秋艳, 磊 石, 帆 黄 申请人:华南理工大学