专利名称：一种高纯度低聚果糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高纯度低聚果糖的生产方法，尤其涉及一种利用固定化酶 生产高纯度低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚果糖(Fructooligosaccharide, FOS),又称蔗果低聚糖或果寡糖，是 由1 - 3个果糖基通过P(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、 蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖是非消 化性糖，具有双歧杆菌增殖功能，是功能性低聚糖的有效成分。迄今为止，市 场上的低聚果糖产品分为两种 一种是低聚糖含量50%左右的低聚果糖(以下 称为FOS50)，其中低聚糖(三糖+四糖+五糖)含量在50°/。左右，其余为葡 萄糖和蔗糖，糖尿病人和肥胖者不能接受；另一种是高纯度低聚果糖，即低聚 糖含量达75 %或更高的低聚果糖，是较理想的低聚果糖产品。
工业化生产高纯度低聚果糖的方法，国内外至今一直采用两步法，即在微 生物(酶)法获得FOS5o基础上，再釆用层析分离法或者纳滤膜分离法将葡萄 糖和蔗糖分离出去，得到高纯度低聚果糖产品。其中国外多用葡聚糖凝胶 SephadexG-10树脂来分离，其分离效果很好，但是这种树脂价格十分昂贵(约 1200美元/公斤)，使得设备投资成本太高，企业难以实现。国内生产高纯度低 聚果糖的企业大多采用截留分子量为300Da的膜组件进行纳滤分离，由于 300Da的膜组件除了滤掉葡萄糖和蔗糖以外，还要把近一半数量的蔗果三糖也 滤掉，其结果是低聚果糖的回收率和产品得率都很低，大约需要消耗3 4吨
FOS5o才能获得1吨低聚糖含量95%左右的高纯度低聚果糖产品(FOS95), 因FOSso的市场价为每吨8000元，光原料成本就高达2.4-3万元/吨，再加 上设备运行时间长，能耗过高，使生产成本居高不下。
中国发明专利ZL 00130200.0采用截留分子量为200Da的膜组件进行纳 滤分离，虽然可以避免蔗果三糖的损失，但是该膜组件只能滤掉单糖，大部分 蔗糖被截留，因此需要增加一次酶反应来转化蔗糖，而且同时需要增加一次脱
盐、脱色工艺，然后进行第二次纳滤，才能获得FOSg5产品，其工艺太复杂，
相当于两次生产低纯度低聚果糖产品的成本加上两次纳滤的成本，其总成本与 300Da膜组件纳滤法几乎一样高。
除了层析法和纳滤分离法外，国内外也有过双酶法或混合酶法生产高纯度 低聚果糖的探索性研究报导。Yun J .W等于1993、 1994年报导，用果糖基转 移酶加葡萄糖氧化酶的双酶系，获得90.05%以上的FOS产品；但这些试验由 于需用过氧化氢酶配套，过氧化氢酶的成本太高，又不能回收，没有工业化应 用价值。国内也有人尝试过双酶法；江南大学江波等1997年报导在采用黑曲 霉单酶法将蔗糖转化为56.64% FOS的基础上，第二步用葡萄糖氧化酶加过氧 化氬酶协同作用，将葡萄糖转化为葡萄糖酸，然后用离子交换法去掉葡萄糖酸， 可获得87%的FOS。这种双酶法的弱点是工业化生产难以实现，原因是葡萄 糖氧化酶没有重复利用，过氧化氢酶的价格太昂贵。据Sigma公司2008年的 报价，货号为C3515的过氧化氢酶售价为785.07元/10mg。
鉴于现有技术的上述缺陷，现有必要提供一种能明显降低成本的工业化生 产高纯度低聚果糖的方法。
发明内容
本发明提供一种能明显降低成本的工业化生产高纯度低聚果糖的方法。本
发明是利用可重复使用的固定化酶来生产高纯度低聚果糖。
本发明的高纯度低聚果糖的制备方法包括以下两个步骤
(1) 制备固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢
模拟酶；
(2) 利用步骤(1)制备的酶用间歇式或连续式的生产方法生产高纯度低 聚果糖。
其中，固定化果糖基转移酶的制备
选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌抹，在合适的培养基中培养，然后将 培养得到的大量菌丝体进行破壁，用离心法将酶分离，用固定化试剂将酶固定下 来。
上面所述的具有能分泌果糖基转移酶的优良菌抹经本发明人进行实验和筛 选，有以下几种可达到要求，它们是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉 (Asperg川us niger)和栖土曲霉(Aspergillus terricola)。
上面所述的合适的培养基包括以下几种物质1-10%蔗糖，1-5%豆粕粉， 0.1-1%玉米粉，其培养方法是在25-35。C，通风比1:0.1-1:1，搅拌速度100-300rpm 条件下，经过15-45小时，获得大量菌丝体。
上面得到的菌丝体必须先进行破壁，收集这些菌体细胞的胞内酶，才获得较 好的果糖基转移酶，所述的菌体破壁可用已知的方法如机械破壁法、冻融法、超 声波破碎法、溶菌酶法等获得果糖基转移酶的混合液，再用离心法将含酶的溶液 分离。
上面所述的用试剂将酶固定化的方法，采用化学偶联法，固定化试剂包括载 体和交联剂，用来固定酶的载体是大孔树脂，所用的交联剂为戊二醛。利用偶联 反应可使吸附在载体上的果糖基转移酶之间以化学键连接起来，达到固定化的目 的。所用戊二醛浓度在0.1-0.9%,过低或过高都影响固定化的效果。
固定化过程中，酶和载体的比例范围是每克载体需酶15-95u,当酶的用量< 15u/g载体时，固定化酶的酶活太低，酶促作用很难发挥出来，但当酶活〉95u/g 载体时，酶的固定化效率太低，部分呈游离酶状态，使用一次后就流失掉。
固定化的条件是pH4-8，温度0-10。C,搅拌速度15-60rpm。固定化操作 果糖基转移酶经分离后，用高效液相色谙法(HPLC)测定其酶活力，按一定的酶/ 载体比例加入载体，混合吸附5 24h后，加入一定浓度的戊二醛溶液，在上迷条 件下，交联反应10-24h,充分洗涤、离心甩干，可得到固定化果糖基转移酶，于 0-10'C保存。
在本发明的另外的实施例中，固定化果糖基转移酶的制备方法，可按照 ZL01128345.9中公开的方法制备，此处不再赘述。 本发明中固定化葡萄糖氧化酶的制备
将游离葡萄糖氧化酶用化学偶联法与载体交联，所用的载体是大孔树脂、 琼脂糖凝胶、烯丙基葡聚糖凝胶或壳聚糖凝胶等，所用交联剂为戊二醛。
固定化的条件是酶和载体的配比是每克载体需酶100 ~ 300 U,在p H 5.0 — 7.0、温度10~ 5CTC、 4觉4半速度10— 100r/min、戊二醛的乡冬浓度为0.05 ~ 0.3%的条件下反应3~ 10h。
所用的游离葡萄糖氧化酶可以是商业酶，也可以用自行筛选和诱变的黑曲霉 菌抹(Asperg川us carbonarius OLG2)，经过种子培养和发酵培养获得菌体后， 再经过破壁、离心分离而提取的葡萄糖氧化酶。该菌林的发酵培养基组成是(以 g/L计)飾30- 50，琼月旨10-20, NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H2O和K2HPO4各0.01 ~ 3.0，调节pH为5.5 ~ 7.5。
固定化葡萄糖氧化酶的制备也可采用壳聚糖和海藻酸盐的界面凝固-交联
耦合固定化法。先将含有发泡剂的海藻酸钠溶液滴入氯化钩溶液，形成一种具 有很多微孔的海藻酸钙凝胶珠；多孔海藻酸钙凝胶珠再和壳聚糖反应形成多孔 微球。由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，而海藻酸盐的分子链上有大量的 羧基，所以壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负电荷的吸引形成聚电解质膜，这 样制备的微胶嚢其球性度和光洁度很好，而且具有很多微孔，其比表面较大， 很适合于作为葡萄糖氧化酶的固定化载体，这样首先解决了固定化栽体选择和 成型问题。其次，由于这种多孔微球中每个微孔的表面是一层壳聚糖凝胶，再
利用带有两个醛基的双功能交联剂戊二醛与壳聚糖和葡萄糖氧化酶通过Schiff 反应而将酶固定在微胶嚢的各个微孔上。这样酶与载体的结合十分牢固，不易 流失，而且只分布在多孔微球中微孔的表面，空间屏障和酶促反应的传质阻力 都很小，提高了固定化酶的活性。 固定化的条件是
将含有0.01~0.20%NaHCO3 (质量分数)的1.0-2.0% (质量分数)海藻酸 钠溶液在蠕动泵加压下通过ct) 1 ~ 2mm针头滴入1.0 ~ 2.0% (质量分数)的 CaCl2溶液，室温放置2-4h,得到白色的海藻酸钩多孔微球。用5%醋酸溶液 配制0.1~0.5%(质量分数)的壳聚糖溶液，按2份溶液1份微球(质量比)投 入海藻酸钙多孔微球，在30-40。C、 200rpm的恒温摇床中摇动20~40min, 用0.5~ 1.0%(质量分数)的CaCl2溶液洗涤，获得海藻酸钙-壳聚糖多孔微球。 取海藻酸钙-壳聚糖多孔微球100g,加5L 5%戊二醛溶液，在25~35°C、 200rpm的恒温摇床中摇动4~6h,蒸馏水反复洗涤以除去残存的戊二醛。按 每克海藻酸钙-壳聚糖多孔微球栽体需葡萄糖氧化酶200~ 500 U,在25~ 35°C、 200rpm的恒温摇床中摇动2~4h，放入冰箱中于4°C下静置过夜，离心、 沉淀，用蒸馏水反复沖洗，过滤即得固定化葡萄糖氧化酶。
本发明中固定化过氧化氢模拟酶的制备 将金属卟啉化合物氯化血红素或血红蛋白用化学偶联法与载体交联，所用 的载体为琼脂糖凝胶、烯丙基葡聚糖凝胶或壳聚糖凝胶等；所用交联剂为戊二
醛。固定化的条件是'pH 8.0-12.0,温度10-5CTC,搅拌速度10-100r/min,
金属卟啉化合物和载体的质量比是每克载体需金属卟啉化合物0.1 ~ 0.3克，交 联剂戊二醛的终浓度为0.05-0.3%,反应时间3-10h。反应结束后，用水洗 涤，并测定其过氧化氢酶活性。
过氧化氢酶的活性中心是铁(in)卟啉。用具有铁卟啉环的天然提取物氯化 血红素(卟啉铁)或血红蛋白作为过氧化氢酶模拟酶，其优点是1、与过氧 化氢酶结构相似，模拟酶的性能好；2、属于天然产物，安全无毒，特别适于 食品工业的使用；3、材料来源于动物血，资源丰富，提取工艺简便，价格不 高。
用间歇式或连续式的生产方法生产高纯度低聚果糖，其中间歇式的分批法生 产高纯度低聚果糖的方法是
在反应罐中，加入20~55% (质量百分数)的蔗糖溶液，按每Kg蔗糖(干) 同时加入1000 ~ 4000U固定化果糖基转移酶、1000 ~ 4000U固定化葡萄糖氧化酶 和1000-4000U固定化过氧化氢模拟酶的酶量，以1.0-3.0 L/min的流速通入空 气，用CaC03粉末控制反应液的pH值，使其维持在4.0-7.0之间，温度在10-50 。C和搅拌速度为50 ~ 200r/min的条件下反应10- 50h,以HPLC检测低聚果糖含 量达标后，用筛网过滤反应液，分离回收固定化酶(固定化果糖基转移酶、固定 化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶)，并用水充分洗涤后作下一批原料的 生产之用。滤液经过精滤、离子交换和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。
连续式的柱式反应法(即一步法)生产高纯度低聚果糖的方法是
将固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶按酶 活比1.0-4.0: 1.0-3.0: 1.0~4.0混合，再和2~8% (质量百分数)的碳酸4丐
颗粒混匀，装入柱式反应器中，以10~60% (质量百分数)的蔗糖溶液在pH4.0 ~7.0，温度10 5(TC下反复通过此柱，以HPLC检测低聚果糖含量达标后过滤， 经离子交换和喷雾千燥成为高纯度低聚果糖产品。
与现有的高纯度低聚果糖的制备方法相比较，本发明的果糖基转移酶、葡 萄糖氧化酶和过氧化氢模拟酶都经过固定化处理，提高了酶的稳定性，并可以 重复使用，提高了酶的利用效率。另外，用廉价的金属卟啉化合物作为过氧化 氢模拟酶代替昂贵的过氧化氢酶，其成本约只有过氧化氢酶的十分之一，这样 能大幅度降低制备高纯度低聚果糖的生产成本。再者，与国外现行的两步法的 高纯度低聚果糖制备方法比较，本发明的制备方法可以用 一 步法从蔗糖直接生 产高纯度的低聚果糖。本发明的工艺流程简短、技术成熟、可搡作性强，而且 生产成本大大降低，适于工业化生产。
说明(1 )本发明所称的糖含量均为质量百分数，低聚糖含量指三糖+四 糖+五糖的总和，各组分糖的含量由高效液相色谱(HPLC)的归一化法计算 而得。
(2) 本发明所称的"低纯度低聚果糖"是指低聚糖含量在50%左右，所 称的"高纯度低聚果糖"是指低聚糖含量在75%以上(含)。
(3) 本发明所接触三种酶的酶活性定义分别如下
果糖基转移酶(fructosytransferase,缩写FTS，酶分类号EG2.4 1.9):测 定方法按国家轻工行业标准QB 2583-2003的附录A，酶活力定义是根据酶供应者 标识的最佳酶化反应的条件下，将蔗糖转化为低聚果糖每分钟产生1 nmol蔗果三 糖所需酶量为一个酶活力单位(U)。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,缩写GOD，酶分类号EC1.1 3.4):酶活 力测定方法按滴定法(见邬显章著《酶的工业生产技术》，吉林科学技术出版社， 1988年49-53页)，酶活力定义是在35。C的反应温度和所规定的条件下每分钟生产1 ij mol葡萄糖酸所需酶量为一个酶活力单位(U)。
过氧化氢模拟酶酶活力测定方法按滴定法(见B.施特尔马赫著，钱嘉渊译 《酶的测定方法》，中国轻工业出版社，1992年第一版)，酶活力定义是在35。C的 反应温度和所规定的条件下每分钟分解1 y mol过氧化氲所需酶量为一个酶活力 单位(U )。
下面将结合实施例详细介绍本发明的高纯度低聚果糖的制备方法。以下的 实施例仅用来解释本发明，而不应以此来限定本发明的保护范围，根据本发明 的本质所做的等同变化仍属于本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例一
(一) 固定化果糖基转移酶的制备
选取栖土曲霉(Asperg川us terricola)菌种接入含5。/o蔗糖、3%豆粕粉、0.3% 玉米粉培养基的200升发酵罐中，于33。C发酵24小时，得种子培养液。在5000升 发酵罐中，加入培养基溶液，其中含蔗糖5%、豆粕粉3%、玉米粉0.3%。于121 。C灭菌40min，加入种子培养液150升，在33。C、 220rpm的条件下，培养24h， 得到含有菌丝体的发酵液，经离心机离心，分离收集菌丝体，洗涤、破壁、离心 取酶液，经HPLC测定酶活力后，按每40u酶液加入1g载体的比例，在2000升反 应罐中加入酶液和大孔树脂，搅拌均匀，冷却至8。C,吸附12h。加入戊二醛，使 其最终浓度为0.2%,在8。C下反应16小时，过滤取固态物，充分洗涤，离心甩干 水分，即得固定化果糖基转移酶制剂。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制备
谈变黑曲霉(Asperg川us carbonarius OU32 )菌种接入含2 ~ 3。/。蔗糖，1~ 2%琼月旨，1-2。/o酵母提取物和NaN03 、 MgS04 ■ 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H20
和K2HPO4各0.001 ~ 0.3%培养基的100升种子发酵罐中，调节pH为5.5-7.0,于 33。C培养16 h，得种子培养液。在3000升发酵罐中，加入培养基溶液，其中含3~ 5%蔗糖，1 ~2%琼月旨，NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04 4H2C^K2HP04 各0.001~0.3%,于120 。C灭菌30 min, 加入种子培养液80升，在33 。C , 200r/min的条件下培养30 h，得含菌丝体的发酵液，离心分离收集菌丝体，洗涤、 破壁、离心取酶液，超滤浓缩得到萄萄糖氧化酶的粗酶液，用滴定法测定其酶活 力。
在100升反应罐中，30-40。C下，按每克栽体(湿)力。入100~ 300 U酶液 的比例，加入10Kg的壳聚糖凝胶(湿)和100~ 300万U的酶液，搅拌混匀后 加入戊二醛，使其终浓度为0.05~0.2%,在pH 5.0-7.0， 30-40。C下反应4 6h ，过滤取固态物，用去离子水充分洗涤，离心甩干、成型，即得固定化萄糖 氧酶制剂。
(三) 固定化过氧化氢模拟酶的制备
在100升反应罐中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液50L, 30 40。C下加入卟啉 铁2.5Kg搅拌至完全溶解。按卟啉铁壳聚糖凝胶=1.0 ~ 3.0: 10.0的质量比，加 入10-25Kg的壳聚糖凝胶(湿)，搅拌混匀后加入戊二醛，使其终浓度为0.05 0,2%%,在pH 9.0-12.0, 30 4(TC下反应4 8 h ,过滤取固态物，用去离子 水充分洗涤，离心甩千、成型，即得固定化过氧化氢模拟酶。用滴定法测定其酶 活力。
(四) 固定化酶法生产高纯度低聚果糖
在2.2M3的反应罐中，加入50~55% (质量百分数)蔗糖溶液2000 Kg，加 入固定化果糖基转移酶制剂125 ~ 380万U、固定化萄糖氧酶制剂100 ~ 300万U和 固定化过氧化氢模拟酶150-400万U,以1.0-3.0 L/min的流速通入空气，用 CaC03粉末控制反应液的pH值，使其维持在5.0-7.0之间，在30-45'C和搅拌速
度为50~ 200r/min的条件下反应12 ~ 30h,以HPLC检测低聚果糖含量达标后， 用筛网过滤反应液，分离回收固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定 化过氧化氢模拟酶，并用水充分洗涤后作下一批原料的生产之用。滤液经过精 滤、离子交换和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。
实施例二
(一) 固定化果糖基转移酶的制备
选取栖土曲霉(Aspergillus terricola)菌种接入含5。/。蔗糖、3%豆粕粉、0.3% 玉米粉培养基的200升发酵罐中，于33。C发酵24小时，得种子培养液。在5000升 发酵罐中，加入培养基溶液，其中含蔗糖5%、豆粕粉3%、玉米粉0.3%。于121 。C灭菌40min,加入种子培养液150升，在33。C、 220rpm的条件下，培养24h，
得到含有菌丝体的发酵液，经离心机离心，分离收集菌丝体，洗涤，破壁，离心 取酶液，经HPLC测定酶活力后，按每40u酶液加入1g载体的比例，在2000升反 应罐中加入酶液和大孔树脂，搅拌均匀，冷却至8。C,吸附12h。加入戊二醛，使 其最终浓度为0.2%，在8。C下反应16小时，过滤取固态物，充分洗涤，离心甩干 水分，即得固定化果糖基转移酶制剂。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制备
诱变黑曲霉(Asperg川us carbonarius 0LG2 )菌种接入含2~3%蔗糖，1 ~2%琼月旨，1 ~2%酵母提取物和NaN03 、 MgS04-7H20 、 KCI 、 FeS04-4H20 和K2HP04各0.001 ~ 0.3°/。培养基的100升种子发酵罐中，调节pH为5.5-7.0，于33。C培养16 h,得种子培养液。在3000升发酵罐中，加入培养基溶液， 其中含3~5%蔗糖，1 ~2%琼月旨，NaN03 、 MgS04 7H20 、 KCI 、 FeS04.4H20 和K2HP04各0.001 ~ 0.3%,于120 。C灭菌30 min， 加入种子培养液80升， 在33。C， 200r/min的条件下培养30 h，得含菌丝体的发酵液，离心分离收集 菌丝体，洗涤、破壁、离心取酶液，超滤浓缩得到萄糖氧化酶的粗酶液，用滴
定法测定其酶活力。
将含有0.01 0.20。/oNaHC03(质量分数)的1.0 ~ 2.0% (质量分数)海藻酸钠 溶氣在蠕动泵加压下通过cM -2mm针头滴入1.0-2.0% (质量分数)的CaCI2 溶液，室温放置2 4h,得到白色的海藻酸钙多孔微球。用5%醋酸溶液配制 0.1~0.5%(质量分数)的壳聚糖溶液，按2份溶液1份微球(质量比)投入海 藻酸4丐多孔微球，在30-4(TC、 200rpm的恒溫摇床中摇动20-40min，用0.5 ~1.0%(质量分数)的CaCl2溶液洗涤，获得海藻酸钙-壳聚糖多孔微球。取该 微球100g，力。5L5。/。戊二醛溶液，在25-35。C、 200rpm的恒温摇床中摇动4 ~6h,蒸馏水反复洗涤，以除去残存的戊二醛。
在100升反应罐中，30-4(TC下，按每克多孔微球载体(湿)加入200~ 500 U酶液的比例，加入10Kg的多孔微球载体(湿)和200~ 500万U的酶液，在 25~35°C、 200rpm的恒温摇床中摇动2-4h，放入冰拒中于4。C下静置过夜，离 心，沉淀用去离子水反复冲洗，离心甩干，即得固定化葡萄糖氧化酶制剂。
(三) 固定化过氧化氬模拟酶的制备
在100升反应罐中，加入去离子水50L, 30-40。C下加入血红蛋白3Kg搅拌至 完全溶解。按血红蛋白壳聚糖凝胶=2.0-3.0: 10.0的质量比，加入10 15Kg 的壳聚糖凝胶(湿X搅拌混匀后加入戊二醛，使其终浓度为0.05~0.2%%,在pH 5.0-7.0， 30-40。C下反应4-8 h ,过滤取固态物，用去离子水充分洗涤，离心 甩干、成型，即得固定化过氧化氢模拟酶。用滴定法测定其酶活力。
(四) 固定化酶法生产高纯度低聚果糖
在3.5M3的反应罐中，加入50~55% (质量百分数)蔗糖溶液3000 Kg，加 入固定化果糖基转移酶制剂200 ~ 550万U、固定化萄糖氧酶制剂150 ~ 450万U和 固定化过氧化氢模拟酶220- 560万U,以1.0-2.0 L/min的流速通入空气，用 CaC03粉末控制反应液的pH值维持在4.5 ~ 7.0之间，在30 ~ 45。C和搅拌速度为
100 200r/min的条件下反应12 28h,以HPLC检测低聚果糖含量达标后，用筛 网过滤反应液，分离回收固定化酶一固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶 和固定化过氧化氢模拟酶，并用水洗涤后作下一批原料的生产之用。滤液经过精 滤、离子交换和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。 实施例三
(一) 固定化果糖基转移酶的制备，按ZL 01128345.9的实施例一操作。
(二) 固定化葡萄糖氧化酶的制备
固定化载体按实施例二方法制备，取市售商业萄糖氧化酶的粗酶液，经滴定 法测定酶活力后，在100升反应罐中，30 40'C下，按每Kg多孔微球载体(湿) 加入20万~ 50万U酶液的比例，加入20 Kg的多孔微球载体(湿)和40万~ 100 万U的酶液，在25 35。C、 200rpm的恒温摇床中摇动2-4h,放入冰拒中于4 。C下静置过夜，离心、沉淀，用去离子水反复沖洗，离心甩干，即得固定化葡萄 糖氧化酶制剂。
(三) 固定化过氧化氢模拟酶的制备
在200升反应罐中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100L， 30 40。C下力。入吟 啉铁5Kg搅拌至完全溶解。按卟啉铁壳聚糖凝胶=1.0 ~ 3.0: 10.0的质量比， 加入20~ 50Kg的壳聚糖凝胶(湿)，搅拌混匀后加入戊二醛，使其终浓度为0.05 ~0.2%%,在pH 9.0-12.0， 30~ 4(TC下反应4-8 h ,过滤取固态物，用去离 子水充分洗涤，离心甩干、成型，即得固定化过氧化氢模拟酶。用滴定法测定其 酶活力。
(四) 固定化酶法生产高纯度低聚果糖
将固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氬模拟酶的酶 活比按1.2-3.8: 1.0-3.0: 1.5~4.0混合，再和2~8% (质量百分数)的碳 酸钓颗粒混匀，装入柱式反应器中，以10 50。/。(质量百分数)的蔗糖溶液在pH4.8
~7.0,温度30-5CrC下反复通过此柱，以HPLC检测低聚果糖含量达标后，过滤 回收固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶，滤液 经离子交换和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。
权利要求
1.一种高纯度低聚果糖的生产方法，其包括以下步骤(1)制备固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶；(2)利用步骤(1)制备的酶用间歇式或连续式的生产方法生产高纯度低聚果糖。
2、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述 制备固定化果糖基转移酶的方法为选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌 林，在合适的培养基和培养条件中培养，然后将培养得到的菌丝体进行破壁， 用离心法将酶分离，用固定化试剂将酶固定下来，其中，所迷的优良菌林为米 曲霉、黑曲霉或栖土曲霉。
3、 如权利要求2所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述的合 适的培养基包括以下几种物质1 ~ 10% (质量分数)蔗糖，1~5% (质量分数) 豆粕粉，0.1 ~ 1%(质量分数)玉米粉，所述的培养条件包括培养温度25-35。C, 通风比为1:0.1 ~ 1:1,搅4半速度100 — 300rpm。
4、 如权利要求2所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述 的用固定化试剂将酶固定下来，所用的固定化方法为化学偶联法，所述的固定 化试剂包括载体和交联剂，其中所述载体为大孔树脂，所述交联剂为戊二醛。
5、 如权利要求4所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，固定化过 程中酶和载体的比例范围是每克载体对应15- 95u的酶，固定化条件是pH4 8， 温度0-10。C，搅拌速度15-60rpm,其中固定化包括以下操作步骤果糖基转 移酶经分离后，测定其酶活力，按上述的酶/载体比例加入载体，混合吸附5-24h 后，加入0.1 ~ 0.9。/。浓度的戊二醛溶液，在上述条件下，交联反应10-24h，洗 涤、离心甩千，可得到固定化果糖基转移酶，于o icrc保存。
6、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，固定化葡萄糖氧化酶是将游离的葡萄糖氧化酶用化学偶联法与载体交联，所用的栽体是天 然的或合成的高聚物，所用交联剂为戊二醛。
7、 如权利要求6所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述载体为交联琼脂糖凝胶、交联烯丙基葡聚糖凝胶或者交联壳聚糖凝胶。
8、 如权利要求6或7所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于， 固定化过程中酶和载体的配比是每克栽体对应100-300 U的葡萄糖氧化酶， 固定化是在pH 5.0-7.0、温度10-5(TC、搅拌速度10-100r/min、戊二醛的 终浓度为0.05~0.3%和反应3~ 10h的条件下进行的。
9、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，固定化葡 萄糖氧化酶的制备方法为壳聚糖和海藻酸盐的界面凝固一交联耦合固定化法。
10、 如权利要求9所迷的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述的 壳聚糖和海藻酸盐的界面凝固一交联耦合固定化法是先将含有发泡剂的海藻酸 钠溶液滴入氯化钙溶液，形成一种具有很多微孔的海藻酸钙凝胶珠；多孔海藻酸 4丐凝胶珠再和壳聚糖反应形成具有很多微孔的微球；再用交联剂戊二醛与壳聚糖 和葡萄糖氧化酶通过Schiff反应而将酶固定在微球的微孔上。
11、 如权利要求10所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述的 壳聚糖和海藻酸盐的界面凝固 一 交联耦合固定化法详细过程为将含有 0.01~0.20%NaHCO3 (质量分数)的1.0 ~ 2.0% (质量分数)海藻酸钠溶液在蠕动泵 加压下滴入1.0 2.0% (质量分数)的CaCl2溶液，室温放置2 4h,得到白色的海 藻酸钓多孔微球；用5%醋酸溶液配制0.1~0.5%(质量分数)的壳聚糖溶液，按2份 溶液1份微球(质量比)投入海藻酸钙多孔微球，在30 4(TC、 200rpm的恒温 摇床中摇动20 40min,用0.5 ~ 1.0。/。(质量分数)的CaCl2溶液洗涤，获得海藻酸 钙-壳聚糖多孔微球；取海藻酸钙-壳聚糖多孔微球100g,加5L 5% (质量分数) 戊二醛溶液，在25- 35。C、 200rpm的恒温摇床中摇动4-6h,蒸馏水洗涤除去残 存的戊二趁；按每克海藻酸鈣-壳聚糖多孔微球栽体需葡萄糖氧化酶200 500 U 的量加入葡萄糖氧化酶，在25- 35。C、 200rpm的恒温摇床中摇动2-4h，放入冰 箱中于4。C下静置过夜，离心，沉淀用蒸馏水冲洗，过滤即得固定化葡萄糖氧化 酶。
12、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，固定化 过氧化氢模拟酶的制备方法为金属卟啉化合物用化学偶联法与载体交联，其中 所用的载体是天然或合成高聚物，所用交联剂为戊二醛。
13、 如权利要求12所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，所述载 体为交联琼脂糖凝胶、交联烯丙基葡聚糖凝胶或者交联壳聚糖凝胶，所述金属卟 啉化合物为氯化血红素或者血红蛋白。
14、 如权利要求12所述的高纯度低聚果糖的生产方法，其特征在于，固定化 过氧化氢模拟酶的制备是在pH 8.0-12.0，温度10 50。C，搅拌速度10-100r/min条件下进行，其中，金属卟啉化合物和载体的质量比是每克载体需金属 吟啉化合物0.1 ~ 0.3克，交联剂戊二醛的终浓度为0.05-0.3%反应时间3 10h, 反应结束后，洗涤，测酶活性。
15、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述 的间歇式生产方法是在反应罐中，加入蔗糖溶液，同时加入固定化果糖基转 移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶，通入空气，控制反应液 的pH值，在一定温度和搅拌速度下反应10~50h,监测反应液中低聚果糖的 含量，果糖含量达标后，过滤反应液，分离回收固定化酶，然后滤液进一步精滤、离子交换和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。
16、 如权利要求15所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，往 反应罐中加入的蔗糖和固定化酶的含量为每Kg蔗糖加入1000-4000U固定 化果糖基转移酶、1000~4000U固定化葡萄糖氧化酶和1000-4000U固定化过氧化氢模拟酶。
17、 如权利要求16所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，所 述通入空气的量为1.0-3.0 L/min。
18、 如权利要求15所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，是 用CaC03来控制反应液的pH值在4.0~ 7.0之间。
19、 如权利要求1所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，所述 的连续式反应法是将固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过 氧化氢模拟酶按比例混合，再和碳酸钙颗粒混匀，装入柱式反应器中，以10 ~30% (质量百分数)的蔗糖溶液在pH4.0~7.0、温度10 4(TC下反复通过 此柱，监测低聚果糖的含量，低聚果糖含量达标后，过滤反应液，经离子交换 和喷雾干燥成为高纯度低聚果糖产品。
20、 如权利要求19所述的高纯度低聚果糖的制备方法，其特征在于，柱 式反应器中，固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模 拟酶的比例是1.0-4.0: 1.0-3.0: 1.0-4.0;所述碳酸钙的质量百分数是2 ~ 8 % 。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度低聚果糖的制备方法，尤其涉及一种用固定化酶来制备高纯度低聚果糖的方法。本发明的制备方法先制备固定化果糖基转移酶、固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶；然后利用上述制备的酶用间歇式或连续式的生产方法制备高纯度低聚果糖。本发明的制备方法中使用廉价的金属卟啉化合物作为过氧化氢模拟酶代替昂贵的过氧化氢酶；果糖基转移酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢模拟酶都经过固定化处理，可以回收再利用，提高了酶的稳定性和利用效率，大大降低了制备高纯度低聚果糖的生产成本。本发明的制备方法可以用一步法从蔗糖直接生产高纯度低聚果糖。
文档编号C12N11/04GK101368195SQ20081003033
公开日2009年2月18日 申请日期2008年8月22日 优先权日2008年8月22日
发明者姚评佳, 曾宪纲, 曾宪经, 曾昭政, 梁锦添, 谢庆武, 谢拥葵, 陈子健, 陈振鹏, 魏远安 申请人:江门量子高科生物工程有限公司