专利名称：大肠杆菌o157恒温核酸扩增快速检测试剂盒及其用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，具体涉及一种大肠杆菌0157恒温核酸扩增快速检测 试剂紐其用法。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157是一种重要的人兽共患病病原菌.主要il3S食物和水源传播， 该病可引繊泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症加S)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。 HUS和TTP的病情凶险，病死率高。自1982年美国首次分离出该菌以来，世界各地不断有散发和暴 发的报告。我国近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致 病菌，存在着疫清暴发、流行的潜在麵。由于大肠杆菌0157感染剂量樹氐，食入不足100个细菌 就可引起疾病，且病程急，病情严重；此外，除临床样品外，对水及食品等微生物区系复杂的样 品进行检湖附，在这些样品中致病菌的数量可能很少，因此筛检大肠杆菌0157的方法是否灵敏、 特异及快速至关重要。随着分子生物学技术的飞速发展使这种要求成为可能。
采用特异序列的原位扩增可便于探测细菌细胞内部的单拷贝功能基因。多种版本的原核原位 PCR(聚合酶链反应)和反转录PCR(聚合酶链反应)法已经发展到可以探测单细胞的特异基因的水 平。早期的报告指出，HNPP—Fast Red TR体系曾用于原位PCR产品的高灵鹏检测。然而，原 位PCR有许多不利的因素(1)由于透化作用与热循环的作用，扩增产品中的细胞被损坏，这使 得劍门难以使用荧光标记抗体鄉行同步的细胞识别；(2)细胞壁的不渗透性和由DNA聚合酶抑 制剂引起的PCR扩增反应中的干扰会产生假的阴性结果；(3)已标记的扩增产物的扩散，及包含 它的细胞所弓l起的阳性结果，或者通过切口转译活动产生糊一特异性结合的有标记的核苷^;躬I 起的阳性结果，都缝成假阳性结果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，掛共一种大肠杆菌0157恒温核酸扩增快速检测试齐U盒 及用法。
为达到本发明的目的，采用以下技术方案
本发明的一种大肠杆菌0157恒温核酸扩增快速检测方法，其试剂包括 (D弓卿混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/Ml，引物序歹咖下
夕卜弓l物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG;
夕卜弓l敝ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
内引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG;
内引物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; ②磷酸缓冲液； (D多聚甲醛为2-4%质量；
④多聚赖氨酸为O. 03-0. 05%质量；
溶菌酶溶液浓度为O. 6《8mg/ml;
⑥ 蛋白,浓度为0.1-0.3mg/ml;
⑦ RNA酶浓度为1-2mg/ml;
⑧ BWDNA聚，(嗜热脂肪芽胞杆SDNA酶大片段)浓度为8U4tl; (D反应缓冲液lOmMdNTP (脱氧核糖核苷酸)lOxThemioPol (耐热聚合酶)反应缓冲
液:150mMMgSCXr8:5:2体积； ⑩样品预处理液pH7.0-8.0、 20mMTris-HCl (三羟甲基氨基甲垸盐酸盐)，2mMEDTA
(乙二胺四乙酸)，1.2% TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)； @显色剂荧光染料l-2mg/ml DAPI (4,6- -2-苯基吲哚二盐酸盐)； 系列浓度乙醇溶液为30-70%体积乙醇、70-90%体积乙醇、90-100%体积乙醇； 阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。 所述的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.0-8.0、 1.5mM KH2P04。
用上述试剂盒检测大肠杆菌Ol 57的方法包括以下步骤
1)被检样品的预处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清液；上清液依次
做10倍稀释度稀释，針稀释度取0.5-2!111涂平 行细胞计数；离心，沉淀上清中的细 胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次,240/。质量多聚甲醛固定15-20h;细脱悬浮液1(M0W 滴加到用O. 03-0. 05%质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；
(2) 细胞壁ffljg性处理将固定好的细胞分别置于30-70%， 70-90%, 90-100%体积的乙醇液 中各处理l-3min，进行脱水；用0.6-0.8mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10-15min， 达到部分降解细胞壁的目的，其中溶菌酶用样品预处理液溶解；用0.1-0.3Mg/ml的蛋白酶 K室温下处理细胞8-12min，去除细胞壁以及与DNA结合的蛋白；最后用l-2mg/ml的RNA 酶处理12-15 min;
(3) 环介导等温扩增反应在50-20(WPCR管配置反应体系，加入引物混合液3-12W，反应 缓冲液4.75-19|4， B" DNA聚合斷.25-114，模柳NA卜4W，加水至12. 5-5(￥1;将配 置好的反应混合液滴加至個定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应1-1.5h; 所用阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA;
(4) 反应结束后，将玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色10-12min，然后在无菌水中漂洗， 自然干；
(5) 分析判断反应产物结果。将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调M距，打开荧光， 在卞鹏中看至微发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，细胞形态以阳 性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果，在荧 光显微镜下最低可以检测到1个细胞，未发现假阳性。
步骤(3)所述的恒温反应SS在63-65"C范围。
步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为15-20h。
步骤(1)所述的离心取上清液的,为1000-2000 rpm，时间为l-2min。
步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的转速为10000-15000rpm，时间为l-5min。
步骤(4)戶;M的漂洗次数为2次以上，优选2次，时间为每次12min。
本发明的一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法有以下有益效果
1、 高特异性本发明根据大肠杆菌0157K 7基因保守区设计了四雑异性引物 外引物I: GCTATACCACGTTACAGCGTG;
外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
内引物1: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 内引物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAAnTGCC;
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断革巴标物质的存在与否，阳性率可达大于99%， 假阳性率小于1%;
2、 无需增菌检测之前不需要对待检菌进1fi咅养；
3、 实现样品原位检测在不增菌的条件下，直接对样本中的病原菌微生物进行原位基因扩增;
4、 快速、高效扩增扩增在不到2h即可完成，且产率高；
5、 灵驗高在复杂体系中可检观倒单个细胞的靶目标，最低检领贩限达到10CFU/ml，标本
的检出率达到99%;
6、 鉴定简便通过荧光显微镜观察细胞是否发荧 行鉴定，无需电泳等其他樹可分析步骤。
具体实肺式 魏例l
按下列配方配置大肠杆菌0157恒温基因扩增快速检测试剂盒 弓嫩混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/nl，引物序列如下 夕卜弓嫩l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
内引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATrCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 内弓l敏CTGTGACAGCTGAAGCnTACGCGAAATCCCCTCTGAATITGCC; 磷酸缓冲、舰BS: 137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.0、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛为2%质量； 多聚赖氨酸为0.03%质量；
溶菌膝浓度为0.6mg/ml; 蛋白献浓度为O. lmg/ml; RNA酶浓度为lmg/ml; Bs,DNA聚合酶浓度为8乖反应缓冲液10mM dNTP， 50W lOXThemoPol Buffer, 20W 150mM MgS04; 样品预处理液pH7.0、 20mMTris-HCl， 2mMEDTA， 1.2%TritonX-l00; 系列浓度乙醇溶液为30%体积乙醇、70%体积乙醇、90%体积乙醇； 显色剂荧光染料lmg/mlDAPI;
阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。
用上述试剂盒按以下方法对大肠杆菌0157进行检测
1、被检样品的预处理
(1) 将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取0.5! 1细胞悬浮液于将待检测样品悬浮于离心管 中，1000ipm离心2min,取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀释度稀释，針稀释度取0.51111涂平板进行细胞计数；
(3) 10000rpm离心5min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，2%多聚甲醛 固敦Oh;
(4) 细胞悬浮液lOMl滴加到用多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中.自然风干。
2、 细胞壁ffl3g性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于30%， 70%， 90。/。浓度的乙醇液中各处理2min，进行脱水；
(2) 用0.6mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞15min，其中溶菌酶用样品预处理液溶解；
(3) 用0.1Mg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞12min;
(4) 最后用lmg/ml的RNA酶处理15min。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应
(1) 在5(MPCR管配置反应体系加入3pl引物混合液，反应缓冲液4.75W， BstDNA聚合 酶0.25Ml (8U)， ,DNA1W，加水至12.5l4;
(2) 将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；63'C恒温反应1. 5h。
4、 反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色12min，然后在无菌水中漂洗两次，每次 12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果。将千燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视 野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而 荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。在荧光显微镜下最低可以检测到1个细胞，未发现假阳 性。
实施例2
按下列配方配置大肠杆菌0157恒温基因扩增快速检测试剂盒 引物混合液混合液中四条引物浓度均为lOpmo,，引物序列如下 外引物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
内引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCG1TGACTACTTCTTATCTGG;
内引做CTGTGACAGCTGAAGCnTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; 磷酸缓冲、鞭BS: 137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.2、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛为3%质量； 多聚赖氨酸为0.04%质量；
溶菌酶浓度为0.7mg/ml; 蛋白鹏浓度为0.2mg/ml; 腿酶浓度为lmg/ml; Bs,DNA聚合酶浓度为8U/Ml;
反应缓冲液80)4 10mM dNTP， 50l4 lOXThemoPol Buffer, 20)-i1 150mM MgS04; 样品预处理液pH8.0、 20mMTris陽HCl， 2mMEDTA， 1.2% Triton X-100; 系列浓度乙醇溶液为60%体积乙醇、80%体积乙醇、100% #|只乙醇； 显色剂荧光染料lmg/mlDAPI;
阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。 用上述试剂盒按以下方法对大肠杆菌0157进行检测
1、被检样品的预处理
(1) 将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取lml细胤悬浮液于离心管中，1000ipm离心2min， 取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀释度稀释，^稀释度取lml涂平板进行细胞计数；
(3) 12000rpm离心3min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3%多聚甲醛 固定16h;
(4) 细胞悬浮液2(M滴加至,多mil氨酸处理过的玻璃板孔中，自然风干。
2、 细胞壁鹏性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于60%， 80%， 100%浓度的乙醇液中各处理lmin，进行脱水；
(2) 用0.7mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞12min,其中溶菌酶用样品预处理液溶解;
(3) 用0.2Mg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞10min;
(4) 最后用lmg/ml的RNA酶处理15min。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应
(1) 在50WPCR管配置反应体系加入6pl弓l物混合液，反应缓冲液9. ， B对DNA聚合 酶0.5)4 (8U)，模板DNA2W，加水至25nl;
(2) 将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板 L中，聚酯封层；64'C恒温反应1.2h。
4、 反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色12min，然后在无菌水中漂洗两次，每次 12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果。将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在
视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到
而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。在荧光显微镜下劇氐可以检测到1个细胞，未发现假阳性。
实施例3
按下列配方配置大肠杆菌0157恒温基因扩增快速检测试剂盒-引物混合液混合液中四条引物浓度均为lOpmo,,引物序列如下-外引物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 夕卜弓l物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
内引物l: GCTC1TGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 内弓l物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; 磷酸缓冲淑BS: 137mMNaCl,2.7mMKCl,8.1mMNa2HP04，pH8、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛为4%质量； 多聚赖氨酸为0.05%质量；
溶菌酶溶液浓度为0.8mg/ml; 蛋白酶K:浓度为0.3mg/ml; RNA酶浓度为2mg/ml; B对DNA聚合酶浓度为8U/^1;
反应缓冲液8(M 10mM dNTP， 5(M lOXThemoPol Buffer,150mM MgS04; 样品预处理液pH8.0、 20mMTris-HCl， 2mMEDTA， 1.2% Triton X-l00; 系列浓度乙醇溶液为70%体积乙醇、90%体积乙醇、100%体积乙醇； 显色剂荧光染料2呢MDAPI;
阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA,阴性对照为不含模板的反应混合液。
用上述试剂盒按以下方法对大肠杆菌0157进行检测
1、被检样品的预处理
(1) 将待检样品悬浮于磷酸缓冲溶液中，取2ml细胞悬浮液于离心管中，2000ipm离心lmin， 取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀释度稀释，^h稀释度船ml涂平板进行细胞计数；
(3) 15000ipm离心lmin沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，4%多聚甲醛 固定15h;
(4) 细胞悬浮液4(^1滴加到用多 氨酸处理过的玻璃板孔中，自然风干。 2、细胞壁M性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于70%， 90%， 100%浓度的乙醇液中各处理0.5111111，进行脱水；
(2) 用0.8mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10min，其中溶菌酶用样品预处理液溶解;
(3) 用0.3Mg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞8min;
(4) 最后用2mg/ml的RNA酶处理12min。
3、环介导等温扩增(LAMP)反应
(1) 在200WPCR管配置反应体系加入12pl弓l物混合液，反应缓冲液， DNA聚合 酶1W，模板DNA4W，加水至50W;
(2) 将配置好的反应混合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；65卩恒温反应lh。
4、 反应结束后，将玻片置于2mg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂洗两次，每次 12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果。将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调鶴距，打开荧光，在视 野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而 荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。在荧光显微镜下最低可以检测到1个细胞，未发现假阳 性。
权利要求
1、一种大肠杆菌O157大肠杆菌恒温核酸扩增快速检测试剂盒，其特征在于，试剂包括①引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下外引物1GCTATACCACGTTACAGCGTG；外引物2ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC；内引物1GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；内引物2CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC；②磷酸缓冲液；③多聚甲醛为2-4％质量；④多聚赖氨酸为0.03-0.05％质量；⑤溶菌酶溶液浓度为0.6-0.8mg/ml；⑥蛋白酶K浓度为0.1-0.3mg/ml；⑦RNA酶浓度为1-2mg/ml；⑧Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl；⑨反应缓冲液10mMdNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mMMgSO4＝8∶5∶2体积；⑩样品预处理液pH7.0-8.0、20mMTris-HCl，2mMEDTA，1.2％TritonX-100； id="icf0001" file="A2008100303330002C1.tif" wi="4" he="4" top= "138" left = "23" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>显色剂荧光染料1-2mg/mlDAPI； id="icf0002" file="A2008100303330002C2.tif" wi="4" he="4" top= "145" left = "23" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>系列浓度乙醇溶液为30-70％体积乙醇、70-90％体积乙醇、90-100％体积乙醇； id="icf0003" file="A2008100303330002C3.tif" wi="4" he="4" top= "153" left = "23" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>阳性对照为O157大肠杆菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。
2、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，戶腿的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mM KC1， 8.1mMNa2HP04， pH 7.0-8.0、 1.5mMKH2P04。
3、 一种用权利要求1所述的试剂盒检测大肠杆菌0157的方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 被检样品的预处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清液；上清液依次做IO 倍稀释度稀释，*稀释度取0.5-21111涂平板进行细胞计数；离心，沉淀上清中的细胞，然后 用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，24%质量多聚甲醛固定15-2011;细胞悬浮液1040W滴加至, 0.03-0. 05%质量多 氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；(2) 细胞壁M性处理将固定好的细胞分别置于30-70%， 70-90%， 90-100%体积的乙醇液中各 处理l-3min，进行脱水；用0.6-0.8mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10-15min，其中溶 菌酶用样品预处理液溶解；用0.1-0.3Pg/ml的蛋白llK室温下处理细胞8-12min，去除细胞壁以 及与DNA结合的蛋白；最后用l-2mg/ml的RNA酶处理12-15 min;(3)环介导等温扩增反应在50-2(XMPCR管配置反应体系，加入引物混合液3-12Ml，反应缓冲 液4.75-19W， Bst DNA聚合,.25-1W，模板DNA1-叫1，加水至12.5-5(M;将配置好的反 应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应1-1.5h; 所用阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA;(4) 反应结束后，将玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色10-12min，然后在无菌水中漂洗，自然 干；(5) 分析判断反应产物结果。将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视 野中看到 荧光的细胝就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，细胞形态以阳性对照为 准，反之，紫夕卜光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果，在荧光显微镜下最 低可以检领倒1个细胞，未发现假阳性。
4、 根据权禾腰求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的恒温反应鹏在63-65'C范围。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的多聚甲酸固定时间为15-20h。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1 )所述的离心取上清液的转速为1000- 2000 rpm， 时间为l-2min。
7、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的转速为 10000-15000ipm，时间为l-5min。
8、 根据权禾腰求3戶腿的方法，其特征在于步骤(4)所述的漂洗次数为2次，每次12min。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌O157恒温核酸扩增快速检测试剂盒及其用法，试剂盒包括引物混合液，其序列为外引物1GCTATACCACGTTACAGCGTG；外引物2ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC；内引物1GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；内引物2CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC；磷酸缓冲液PBS、多聚甲醛、多聚赖氨酸、溶菌酶、蛋白酶K、RNA酶、BstDNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色剂、阳性对照及阴性对照。利用该试剂盒通过大肠杆菌O157菌体固定处理、细胞通透性处理、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对大肠杆菌O157高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的原位检测。
文档编号C12Q1/10GK101343661SQ20081003033
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月22日 优先权日2008年8月22日
发明者常彦磊, 琳 李, 王秋艳, 磊 石, 帆 黄 申请人:华南理工大学