专利名称：副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测试剂与使用方法，具体涉及一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试 剂細顿方法。
背景技术：
副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起^^源性感染，导致 急性胃肠炎。因此，需要建立一种安全可靠、简便快速的检测方法来保证食品的安全。常规检测 副溶血性弧菌的方法大多要经过增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗 时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病争溯源，费时而且费力，已经不能满足食品生产的控制 要求。
近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血弧菌，PCR方法在操作 时间上以及检测的特异性和灵 方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温 度循环装置，而且它的检领附间也还是比较长(4 8h)，并且反应过程很容易受污斜勿的影响， 从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应鹏的方法， 在一定纟1^上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核, 列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。 ^H种方法的检测水平都 不少于10个拷贝，耗时lh左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标 序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技 术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅 助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA， LAMP)克服 以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速i腿行核酸的扩增，具有很多 的7^1^^4，见文献Notomi T， Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K Amino N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.。该方法 通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进fi^页处理，快速提取被检标本的DNA或RNA;
步骤二特异性弓嫩的制备确定待测标本的耙基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物 各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、弓嫩、反应缓冲
液与BWDNA聚合酶混合，在63 65°0保温0.5至1.511进行循环链置换反应；步骤四、分析判断 反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是 现有技术也有不足之处，主要是1.特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.需要对细 胞或组织破碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；3.为了 满足扩增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；4.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，
不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的
LAMP技术进行舰。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂M 顿方法。
为达到本发明的目的，采用以下技术方案-
按下列配方制备副溶血弧菌等温基因扩增决速检测试剂盒
(D引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol4d，，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
内引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG;
内引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; ②bwdna聚合酶(嗜热脂肪芽胞杆菌DNA酶大片段)浓度为8U/m1; (D蛋白酶K:浓度为0.1-0.2ng/ml; (3)RNA酶浓度为0.4-0.6mg/ml; (D溶菌酶溶液浓度为0.2-0.4mg/ml;
样品预处理液pH 7.0-9.0、 lOOmMTris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，50mMEDTA (乙二胺四乙酸)；
⑦ LAMP反应缓冲液lOmMdNTP (脱氧核糖核苷酸)10xThermoPd (耐热聚合酶)反应 缓冲液150mMMgSO4:5mMBetina (甜，)=8:5:2:10 #^、；
⑧ 磷酸缓冲液；
⑨ M性处理试剂1:为3-5%质量的多聚甲醛；
⑩ ilil性处理试剂2:为0.02-0.04%质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为30-60%体积乙醇、60-80%体积乙醇、80-100%体积乙醇； 复染剂荧光染料l-2mg/mlDAPI (4，6- ^-2-苯基吲哚二盐酸盐)； 阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
所述的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04。
用上述试剂盒检测副溶血弧菌的方跑括以下步骤
(1) 被检样品的预处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；离心，沉淀上 清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3-5%多聚甲醛固定；细脱悬浮液1040nl 滴加到用0.02-0.04%多娜氨酸处理过的玻璃板 沖，风干；
(2) 细胞壁iliS性处理将固定好的细胞分别置于30-60%， 60-80%, 80-100%浓度的乙醇液 中各处理l-3min，进行^7jC;用0.2-0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8-12min;其中溶菌酶用样品预处理液溶解；然后用0.1-0.2pg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞 2-5min，最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理12-17min;
(3) 环介导等温扩增反应；在50-200plPCR管配置反应体系加入3-12pl引物混合液，反应 缓冲液4.75-19pl， BW DNA聚合酶0.25-1 nl，模板DNAl-4pl，加水至12.5-50pl;将配
置好的反应混合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应l-2h; 所用阳性对照副溶血弧菌基因组DNA;
(4) 反应结束后，将玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，无菌水中漂洗，自然干；
(5) 将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在MW中看到激发荧光的 细胞就是阳性结果，细胞形态以阳t^寸照为准，反之，紫外光下可以看到而绿色光激发 下看不到的细胞即为阴性结果；
步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65。C范围。
步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为8-12h。
步骤(1)所述的离心^li:清液的椅速为1000-2000 rpm，时间为l-2min。
步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的糊为10000-15000ipm，时间为l-3min。
步骤(4)所述的漂洗次数为2次以上，,2次，时间为每次12-15min。
本发明的一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂皿使用方法有以下有益效果 1、高特异性本发明根据副溶血弧菌欣基因保守区设计了四雑异性引物
外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG ;外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
内引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG;
内引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT;
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断耙标物质的存在与否，阳性率可达大于99% 假阳性率小于1%;
2、 无需增菌检测之前不需要对待检菌进行培养；
3、 实现样品原位检测在不增菌的条件下，直接X才样本中的病原菌微生物进行原位基因扩增;
4、 快速、高效扩增扩增在不到2h即可完成，且产率高；
5、 灵敏度高在复杂体系中可检观倒单个细胞的靶目标，最低检测极限达到10CFU/ml，标 本的检出率达到99%;
6、 鉴定简便M31荧光显微傲见察细胞是否发荧光进行鉴定，无需电泳等其他{摘分析步骤。
具体实肺式 实施例1
按下列配方制备副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒 引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmoVMl，引物序列如下
外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外弓胸2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
内引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 内引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶浓度为8U4il; 蛋白酶K:浓度为0.1ng/ml; RNA酶浓度为0.4mg/ml; 溶菌酶溶液浓度为0.2mg/ml;
样品预处理液..pH=7.0、 lOOmMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反应缓冲液80nllOmMdNTP， lOxThemoPol Buffer, 20nl 150MmMgSO4, lOOpl 5mM Betina;
磷酸缓冲液；137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04; M性处理试剂l:为3%质量的多聚甲醛； 驗性处理试剂2:为0.02%质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为30%体积乙醇、60%体积乙醇、80%体积乙醇；
复染剂荧光染料lmg/mlDAPI; 阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测
1、 被检样品的菌体固定处理
(1) 取a5ml细胞悬浮液于离心管中，1000rpm离心2min，取上清；
(2) 1000(hpm离心3min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3%多聚甲醛 固定12h; ,
(3) 细胞悬浮液10n摘加至佣0.02。/。多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风 干。
2、 被检样品的细胞壁M性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于30%， 60%， 80Q/。体积的乙lM中各处理3min，进行脱水；
(2) 用0.2mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞12min;
(3) 用0.1ng/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min;
(4) 用0.4mg/ml的RNA酶处理17min，。 3、环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1) 在50WPCR管配置反应体系加入3pl弓l物混合液，反应缓冲液4.75W ， BW DNA聚合 酶0.25W，模板DNA1W，加水至12.5W;
(2) 将配置好的反应混合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；
(3)置于63'C恒温反应2h。
4、 样品复染
反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂洗两次，每 次12min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的 细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不 到的细胞即为阴性结果。 实施例2
按下列配方制备副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒 引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol4d，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
内引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 内引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶浓度为8乖 蛋白IIK:浓度为0.1pg/ml; RNA酶浓度为0.5111^1111; 溶菌酶溶液浓度为03mg/ml ;
样品预处理液pH8.0、 100mMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反应缓冲液80pll0mMdNTP， 50|ul lOxThemoPol Buffer, 20^1150MmMgSO4,100^1 5mM Betina;
磷酸缓冲液137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性处理试剂l:为4%质量的多聚甲醛； M性处理试剂2:为0.03%质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为30%体积乙醇、70%体积乙醇、95%体积乙醇；
复染剂荧光染料lmg/mlDAPI;
阳性对照副溶血弧菌基因纟IDNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测
1、被检样品的菌体固定处理
(1) 取lml细胞悬浮液于离心管中，1 OOOrpm离心2min，取上清；
(2) 12000rpm离心2min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，4%多聚甲醛 固定10h;(3)细脱悬浮液2(^1滴加至佣0.03。/。多聚赖氨酸处理过的玻璃板 L中，生物安全柜中自然风 干。
2、 被检样品的细胞壁M性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于30%， 70%， 95。/。体积的乙醇液中各处理2min，进行脱7K;
(2) 用0.3mg/ml浓度的溶菌酶溶液室、温下处理细胞10min;
(3) 用0.1pg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min;
(4) 用0.5mg/ml的RNA酶处理15min，。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1) 在50nlPCR管配置反应体系lOpmol^l四种弓l物各加lpl， LAMP反应缓冲液12.5^1， B对DNA聚合酶lpl (8U)，加水至25pl;
(2) 将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板 L中，聚酯封层；
(3) 置于63。C恒温反应2h。
4、 样品复染
反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂洗两次， 每次15min，自然干。 5、分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的 细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不 到的细胞即为阴性结果。 实施例3
引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/nl，引物序列如下 外引物l: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 外引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
内引物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG; 内引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT; BrfDNA聚合酶浓度为8U妙 蛋白酶K:浓度为0.2ng/ml; RNA酶浓度为0.6mg/ml; 溶菌酶溶液浓度为0.4mg/ml;
样品预处理液pH9.0、 10QmMTris-HCl， 50mMEDTA;
LAMP反应缓冲液80^ill0mMdNTP， 50nl lOxThemoPol Buffer, 150MmMgSO4， lOOpl 5mM Betina;
磷酸缓冲液；137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04;
M性处理试剂l:为5%质量的多聚甲醛； M性处理试剂2:为0.04%质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液为60%体积乙醇、80%体积乙醇、100%体积乙醇；
复染剂荧光染料2mg/mlDAPI; 阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测 1、被检样品的菌体固定处理
(1) 取2ml细胞悬浮液于离心管中，2000rpm离心lmin，取上清；
(2) 15000ipm离心lmin沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，5%多聚甲醛固 定8h;
(3) 细胞悬浮液40nl滴加至,0.04%多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风 干。
2、 被检样品的细胞壁M性处理
(1) 将固定好的细胞分别置于60%， 80%， 100n/。体积的乙醇液中各处理lmin，进行^7jC;
(2) 用0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8min;
(3) 用0.2ng/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2min;
(4) 用0.6mg/ml的RNA酶处理12min，。
3、 环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1) 在200nlPCR管配置反应体系加入12^1弓嫩混合液，LAMP反应缓冲液19^1， B对DNA 聚合酶ltil(8U)，模板DNA4nl，加水至5(Hd;
(2) 将配置好的反应混合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；
(3) 置于65'C恒温反应lh。
4、 样品复染
反应结束后，将玻片置于2mg/mlDAPI染料中染色5min，然后在无菌水中漂洗两次，每次 15min，自然干。
5、 分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞 就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞 即为阴性结果。
权利要求
1、一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括①引物混合液混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，，引物序列如下外引物1CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2CGGCGAAGAACGTAATGTCT；内引物1cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；内引物2ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；②Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl；③蛋白酶K浓度为0.1-0.2μg/ml；④RNA酶浓度为0.4-0.6mg/ml；⑤溶菌酶溶液浓度为0.2-0.4mg/ml；⑥样品预处理液pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；⑦LAMP反应缓冲液10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO4∶5mMBetina＝8∶5∶2∶10体积；⑧磷酸缓冲液；⑨通透性处理试剂1为3-5％质量的多聚甲醛；⑩通透性处理试剂2为0.02-0.04％质量的多聚赖氨酸； id="icf0001" file="A2008100303400002C1.tif" wi="4" he="5" top= "149" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>系列浓度乙醇溶液为30-60％体积乙醇、60-80％体积乙醇、80-100％体积乙醇； id="icf0002" file="A2008100303400002C2.tif" wi="4" he="5" top= "156" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>复染剂荧光染料1-2mg/ml DAPI； id="icf0003" file="A2008100303400002C3.tif" wi="4" he="5" top= "164" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
2、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述的磷酸缓冲液组分为137mMNaCl， 2.7mM KC1， 8.1mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04。
3、 权禾腰求l恋戶腿的试剂維测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 被检样品的预处理将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；离心，沉淀上清中的 细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3-5%多聚甲醛固定；细胞悬浮液10-40|al滴加到用 0.02-0.04%多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；(2) 细胞壁M性处理将固定好的细胞分别置于30-60%， 60-80%, 80-100%浓度的乙醇液中各 处理l-3min，进行脱水；用0.2-0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8-12min;其中溶 菌酶用样品预处理液溶解；然后用0.1-0.2pg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min，最后用 0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理12-17min;(3) 环介导等温扩增反应；在50-200nlPCR管配置反应体系加入3-12^1弓嫩混合液，反应缓冲 液4.75-19^1， BWDNA聚合酶0.25-1 (il，模板DNA14nl，加水至12.5-50nl;将配置好的反应 混合液滴加至睏定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应l-2h; 所用阳性对照副溶血弧菌基因组DNA;(4) 反应结束后，将玻片置于l-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，无菌水中漂洗，自然干；(5) 将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调M距，打开荧光，在l鹏中看到激发荧光的细脱就 是阳性结果，细胞形态以阳性X寸照为准，反之，紫外光下可以看到而纟絶光激发下看不到的细 胞即为阴性结果；
4、 根据权利要求3所述的方、法，其特征在于步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65。C范围。
5、 根据权利要求3戶;M的方法，其特征在于步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为8-12h。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心取上清液的转速为1000-2000rpm， 时间为l-2min。
7、 根据权禾腰求3戶腿的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的魏为 10000-15000rpm，时间为l-3min。
8、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)所述的漂洗次数为2次，每次12-15min。
全文摘要
本发明公开了一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法，试剂盒包括引物混合液，其序列为外引物1CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2CGGCGAAGAACGTAATGTCT；内引物1cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；内引物2ACACCAACACGTCGCAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶溶液、LAMP反应缓冲液、磷酸缓冲液、通透性处理试剂、乙醇溶液、复染剂、阳性对照。利用该试剂盒通过副溶血弧菌菌体固定处理、细胞通透性处理、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对副溶血弧菌高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的原位检测。
文档编号C12Q1/04GK101358235SQ200810030340
公开日2009年2月4日 申请日期2008年8月22日 优先权日2008年8月22日
发明者常彦磊, 琳 李, 王秋艳, 磊 石, 帆 黄 申请人:华南理工大学