次后，采用含有0. 6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基GT-T551 调整细胞终浓度为2X106个细胞/mL;将细胞接种于预先经过终浓度为5μg/mLCD3单克 隆抗体及终浓度为10μg/mL的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里 加入终浓度为lOOOU/mL的重组人蛋白干扰素-Y和lOOOU/mL的重组人白介素2,在37°C、 饱和湿度为5 %的(?培养箱中培养。
[0066] (3)第四天，向培养瓶中补加100血含有0. 6体积％的胎牛血清的NKT细胞培养基 GT-T551，并加入终浓度为lOOOU/mL的重组人白介素2。于37°C、饱和湿度为5%的(?培 养箱中培养4天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结果见图1，其中 CD3+ ;92. 80% ;CD3+CD4+:28. 25% ;CD3+CD8+:67. 11% ;CD3乂D56+:6. 51% ;CD8乂D56+:6. 00%。
[0067] 实施例2慢病毒表达载体pWPT-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的构建
[0068] (1)NKT细胞cDNA的制备
[0069] 离必沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提 取细胞的总RNA，-8(TC保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevedAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录得NKT细胞cDNA，-2(TC保存备用。
[0070] (2)慢病毒质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的制备
[0071] 设计并合成如下引物序列（其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点）：
[0084]W步骤（1)中NKT细胞cDNA为模板，用引物PI和P2进行PCR扩增，得到长28化p 的CD8的hinge区和跨膜区，核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示，两端分别含有Mlul和BglII 酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构 域，核巧酸序列如56910^.4所示，两端分别含有8肖111和6(3〇1?1酶切位点及保护碱基；用 引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的CD3ζ的胞内信号结构域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，两端分别含有EcoRI和Sail酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相 同，W扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照PHmeSTA^? ; 服DNAPolymerase的说明书，反应体系巧0μL)如下：
[0085]双蒸水；32. 5μΙ
[0086] 5X反应buffer; 10μL
[0087]dNTP混合物（每种 2. 5mM) ;4μL
[0088]P3(10mM) :1μL
[0089]P4(10mM) :1μΙ
[0090]NKT细胞cDNA(200ng/uU; 1μL
[0091] PrimeSTAR'七HSDNAPolymerase:0. 5μL
[009引将上述PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进 行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒 回收备用。
[0093] 慢病毒表达载体pWPT-GFP用Mlul/SalI双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖凝 胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、 CD137、CD3ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Transl-TlPhageResistant化 学感受态细胞，37°C培养1化后挑取单克隆，37°C，250巧m培养1化后用质粒小提试剂盒 提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶Mlul和Sail双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2,其 中，1泳道；DNA分子量标记D2000 ;2泳道；质粒pWPT-GFP的酶切片段（835bp) ;3泳道： 质粒ρΚΡΤ-〔08-〔0137-〔03ζ的酶切片段（756bp)。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远 生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 PWPT-CD8-CD137-CD3ζ。
[0094] (3)慢病毒质粒pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备
[0095] 全基因合成编码大鼠生长激素信号肤和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQIDNO. 8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5'端含有EcoRV酶切 位点、kozak序列，3'端含有Mlul酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为 pGSI-肥RlScFv。质粒经EcoRV/Mlul双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶进行分离，用琼 脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段备用。
[0096]PWPT-CD8-CD137-CD3ζ质粒经限制性内切酶BamHI单酶切，再用Klenow 化agment酶平头，然后进行Mlul单酶切，酶切产物经1 %琼脂糖凝胶进行分离，用 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收有大鼠生长激素信号 肤和肥RlScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连 接产物转化化ansl-TlPhageResistant化学感受态细胞，37 °C培养1化后挑取单 克隆，37 °C，250rpm培养1化后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制 性内切酶BamHI/Sall双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，Ml;DNA分子量标记 D15000 ;1 泳道：质粒pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段（920bp) ;2 泳 道；质粒PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段（774bp) ;3泳道；质粒pWPT-GFP的酶切 片段（853bp) ;M2;DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物 科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括大鼠生长激素信号 肤（核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示）、抗肥R1单链抗体（核巧酸序列如SEQIDNO. 7所 示）、CD8的hinge区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，其 中，该嵌合抗原受体W基因CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域 串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO. 9所示，对应的基因编码序 列如沈QIDNO. 10所示。
[0097] 实施例3嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞的制备
[0098] (1)慢病毒的包装和浓缩
[0099] 用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ 和辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，Η种质粒W4:2:1的质量比用Lipofectamine? 2000TransfectionReagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染4她、72h时收 集病毒上清于50mLEP管中，4°C，2000g离必lOmin，转移两次得到的上清至新EP管中，用 4. 5μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5X阳G6000-NaCl按照4:1的体积比混匀， 4°C静置化，然后4°C，lOOOOg离必20min，弃上清，沉淀用1血的4°C预冷的无菌PBS溶解， 即得嵌合抗原受体的病毒浓缩液，按每管100μL进行分装，-8(TC保存备用。
[0100] 按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pWPT-GFP和辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染 293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色英光蛋白的慢病毒浓缩液。
[0101] (2)慢病毒感染