专利名称：具有共价结合肽的重组t细胞受体配体的制作方法
技术领域：
本公开涉及包含共价连接有肽抗原的主要组织相容性复合物(MHC)多肽的组合物和使用这些组合物以例如调节免疫应答的方法。
背景技术：
哺乳动物对特异性抗原免疫应答的起始由该抗原呈递至T细胞带来。在主要组织相容性复合物(MHC)的情形中，抗原被呈递至T细胞。MHC复合物位于抗原呈递细胞(APC)的表面上；MHC的三维结构包括适合所呈递抗原进入的沟(groove)或裂隙(cleft)。当在存在必需共刺激信号的情况下T细胞上的合适受体与APC上的MHC/抗原复合物相互作用时，所述T细胞被刺激，触发免疫系统激活事件的充分表征的级联的多个方面，包括诱导细胞毒性T细胞功能，诱导B细胞活性和刺激细胞因子产生。哺乳动物中存在两类基本的MHC分子，MHC I类和MHC II类。这两类都是由两个独立的蛋白缔合 形成的大蛋白复合物。每类都包括将所述复合物锚定至细胞膜的跨膜结构域。MHC I类分子由两个非共价缔合的蛋白——α链和β 2-微球蛋白——形成。所述α链包含三个不同的结构域:α 1、α 2和α 3。所述α I结构域和α 2结构域的三维结构形成适合抗原进入用于呈递到T细胞的沟。所述α 3结构域是Ig-折叠样结构域，其含有将α链锚定至APC细胞膜中的跨膜序列。当与抗原缔合时(并且在合适的共刺激信号的存在下)，MHC I类复合物可刺激CD8细胞毒性T细胞，所述细胞起到杀死其特异性识别的任何细胞的作用。所述非共价缔合形成MHC II类分子的两个蛋白被称为α链和β链。所述α链包含αI结构域和α 2结构域，所述β链包含βI结构域和β 2结构域。适合抗原进入的裂隙通过所述αI结构域和βI结构域的相互作用形成。所述α 2结构域和β 2结构域是将所述α链和β链锚定至APC的细胞膜中的跨膜Ig-折叠样结构域。当与抗原缔合时(并且在存在合适的共刺激信号的情况下)，MHC II类复合物可刺激⑶4Τ细胞。⑶4Τ细胞在免疫系统内起多种作用，包括起始炎症应答，调节其他免疫细胞，帮助B细胞进行抗体合成，调制免疫应答以实现对给定抗原的合适免疫应答，分泌细胞因子和/或表达膜结合因
罕坐丁寸οMHC复合物在免疫系统中起的作用已导致开发了将这些复合物用于调节免疫应答的方法。例如，在MHC的情形中，可识别“自身”抗原肽(自身抗原)的活化T细胞在自身免疫性疾病(例如类风湿关节炎和多发性硬化)中起关键作用。因为分离的MHC II类分子(装载有合适的抗原)可替换携带MHC II类复合物的APC并且可结合抗原特异性T细胞，许多人已提出分离的MHC/抗原复合物可用于治疗自身免疫性疾病(参见美国专利N0.5，194，425和 5，284，935)。在另一种情形中，已经表明在缺乏共刺激因子的情况下，分离的MHCII/抗原复合物与T细胞的相互作用可诱导称为无反应性的无应答状态(Quill et al，J.1mmunol.，138:3704-3712，1987)。根据该现象，Sharma 等人(美国专利 N0.5，468，481 和5，130, 297)和Clarke等人(美国专利N0.5，260, 422)已经提出，可在治疗上给予这类分离的MHC 11/抗原复合物以使得对特定自身抗原肽特异性应答的T细胞系无反应。
发明内容
虽然使用分离的MHC/抗原复合物的概念在治疗和诊断应用中具有很好的前景，但是到目前为止报道的各种方法的主要缺点是该复合物是大体积的并因此难于产生和操作。本文表明，重组MHC多肽(例如重组的两个结构域MHC I类多肽或MHC II类多肽)可被共价连接到肽抗原上以产生稳定的复合物。本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC I类或MHC II类重组T细胞受体配体(RTL)多肽的稳定复合物。还公开了制备这类组合物的方法和使用方法，例如治疗或抑制自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇(例如肽抗原)，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α I结构域，其中所述α I结构域的氨基端与所述β I结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC II类多肽不包括α2或β 2结构域。在其 他实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇(例如肽抗原)，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α 2结构域，其中所述α 2结构域的氨基端与所述α I结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC I类多肽不包括α 3结构域。在一些实例中，所述重组MHC多肽在溶液中聚集的倾向降低，例如这样的重组MHC多肽，即在所述MHC多肽的极性氨基酸或荷电氨基酸的β折叠平台(platform)中包括一个或多个疏水性氨基酸置换。在一些实例中，利用所述MHC多肽中天然存在的半胱氨酸残基(例如MHC II类β 结构域的半胱氨酸残基或MHC I类α结构域的半胱氨酸残基)形成二硫键。在其他实例中，利用所述MHC多肽中非天然存在的半胱氨酸残基(例如通过诱变引入至所述MHC多肽的半胱氨酸残基)形成二硫键。在其他实例中，利用所述抗原决定簇中天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键。仍在其他实例中，利用所述肽抗原中非天然存在的半胱氨酸残基(例如通过诱变引入至所述抗原决定簇的半胱氨酸残基)形成二硫键。本文还公开了制备所公开组合物的方法和用于产生所公开组合物的试剂盒。在一些实例中，所述方法包括使用含有一种或多种组分的缓冲液或溶液，以帮助(例如提供充分的条件)在所述重组MHC多肽和所述抗原决定簇之间形成二硫键。本文还提供了使用所公开组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括治疗或抑制受试者中自身免疫性疾病(包括给予有效量的含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的本文公开的重组MHC多肽的组合物)。在具体的实例中，所述自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻或银屑病。根据以下的具体实施方式
，本公开的上述特征和其他特征将变得更加明显，所述具体实施方式
参考附图进行。
图1A是示出“空的”rIAg7 (_)和带有二硫键(disulfide)捕获的胰岛素B:9_23肽的rIAg7 (WT)的考马斯蓝染色的10-20%SDS-PAGE的数字图像。rIAg7/肽作为高分子量种类(29kD、31kD和33kD)迁移。装载样品和处理条件如所示(Red，还原性；NR，非还原性)。图1B的条状图示出对图1A的泳道7和泳道8中所示条带的定量。图2是示出对rIAg7捕获的FITC标记的胰岛素B:9-23肽和变体(如所示)对比的数字图像。rIAg7对野生型胰岛素B:9-23肽(C19)的捕获最有效。如图所示，半胱氨酸移向氨基端(移至第18位；C18)或移向羧基端(移至第20位；C20)的胰岛素B:9-23变体即使在孵育50小时之后仍被捕获，但是效率低很多。肽序列在数字图像下面示出。图3是示出rIAg7捕获肽的时间过程的两张数字图像。在IOOmM NaPO4 (pH6.5)、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN3中将胰岛素B:16-23肽(FITC-YLVCGERG;SEQ ID NO:1)和rIAg7混合(10:1,肽:rIAg7),维持所示的时间。图4的曲线图示出图3所示时间过程的29kD条带和31kD条带的密度测定结果。对考马斯染色的条带进行定量以确定捕获的起始速率。图5是示出存在内部二硫键的rIAg7的总质量测量的两张质谱图。将rIAg7的样品烷基化，或者还原且烷基化。烷基化的rIAg7 (左)示出了在21，416.7Da处的主峰，其与缺失氨基末端甲硫氨酸的rIAg7的21，420.6Da的期望质量非常接近。还原且烷基化的rIAg7 (右)示出了在21，530.3处的主峰，其与缺失氨基末端甲硫氨酸且多出两个额外的烷基的rIAg7的期望质量非常接近。在21，665.5处的次峰与具有完整氨基末端甲硫氨酸且多出两个烷基的rIAg7的21，665.8的期望质量非常接近。图6是纯化的rIAg7和与胰岛素B:9_23肽混合的rIAg7的SDS-PAGE的数字图像(左)。示出了分子量标准。将对应rIAg7的条带和在29kD和31kD处的两个较高分子量条带(中)从凝胶中切出，以胰蛋白酶消化并通过质谱法进行分析。所述rIAg7条带包含二硫键连接的肽，该肽含有完整C17-C79 二硫键(右下)。所述29kD条带和31kD条带都包含二硫键连接的肽，该肽含有与含rIAg7C79的肽AELDTACR (SEQ ID N0:2)交联的胰岛素B:9_23肽(右上)。图7 是装载有 M0G35-55 (WT)、M0G35_55S42C 变体或 M0G35-55P43C 变体的纯化的重组人DR2 (_)的SDS-PAGE的数字图像(左)。装载样品，处理条件都如所示(Red，还原性；NR，非还原性)。在右侧示出了泳道5、泳道6、泳道7和泳道8的密度测定数据(从左到右为DR2条带、29kD条带、3IkD条带和33kD条带)。图8是装载有小鼠M0G35-55S45C变体的重组鼠1-Ab的SDS-PAGE的数字图像。装载样品，处理条件如所示(Red,还原性；NR,非还原性)。 图9是在非常规结合寄存器(register)中结合IAg7的胰岛素B:9-23的模型。当Cysl9占据P4袋，将其置于距离C17-C79内链二硫键合适的距离时，该结合寄存器支持对胰岛素B:9-23的高效氧化还原捕获。图10的图表示出用装载有二硫键捕获的胰岛素B:9-23的rIAg7 (rIAg7_胰岛素)、空rIAg7 (RTL450)或载体(Tris缓冲液)处理的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的存活率。图1lA的曲线图示出用载体、RTL551或装载有二硫键捕获的M0G35-55的RTL550(RTL550-Cys-MOG)处理的小鼠在处理后随时间的EAE得分。图1lB的条状图示出按照图1lA所示处理的小鼠的累积疾病指数。图12A的曲线图示出用载体(未处理)或具有二硫键捕获的M0G35-55的RTL550(RTL550-Cys-MOG)处理的、干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)敲除小鼠在处理后随时间的EAE得分。图12B的条状图示出按照图12A所示处理的小鼠中累积疾病指数。图13A-C是示出MHC II类多肽的预测结构的系列图。图13A是抗原呈递细胞(APC)表面上的HLA-DR2多肽的模型。图13B是示例性MHC II类β I α I分子的模型。图13C是HLA-DR2 β Ia I分子中示例性β折叠平台的模型，示出疏水性残基。图14是人、小鼠和大鼠MHC II类β I a I多肽的氨基酸序列的比对。*表示为了最佳的序列比对所引入的缺口。箭头表示β 1/a I联结。半胱氨酸残基加阴影。斜体表示β I结构域和a I结构域之间的非天然接头残基。RTL302 (DR2)中具有下划线的残基是在改性RTL (在溶液中聚集减少)中被丝氨酸或天冬氨酸置换的残基。序列标识如下:DR2(SEQ ID N0:11)、DR3 (SEQ ID N0:55)、DR4 (SEQ ID N0:56)、DP2 (SEQ ID N0:19)、DQ2(SEQ ID N0:20)、IAs (SEQ ID N0:57)、IAg7 (SEQ ID N0:4)、IAb (SEQ ID NO:14),RTl.B(SEQ ID N0:58)。
序列表 本文提及的公开核酸序列和氨基酸序列使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写(如37C.F.R.1.822中定义的)示出。至少在某些情况情况下，仅显示每个核酸序列的一条链，但任何对所显示链的提及应理解为将互补链包括在内。序列表以命名为Sequence_Listing.txt的文件形式作为ASCII文本文件提交,该文件创建于2011年9月2日，28，991字节，其以引用的方式纳入本文。SEQ ID NO:1是胰岛素B: 16-23肽的氨基酸序列。SEQ ID NO: 2是rIAg7RTL氨基酸73-80的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是胰岛素B:9_23肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:4 是 rIAg7RTL 的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG) 35-55肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是小鼠M0G35-55肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:7是胰岛素B:9_23C18变体的氨基酸序列。SEQ ID N0:8是胰岛素B:9_23C20变体的氨基酸序列。SEQ ID N0:9是胰岛素B:9_23C19A变体的氨基酸序列。SEQ ID NO: 10是rIAg7RTL氨基酸15-25的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是示例性DR2RTL的氨基酸序列。SEQ ID NO: 12 是 hM0G35_55S42C 变体的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13 是 hM0G35_55P43C 变体的氨基酸序列。
SEQIDNO: 14 是 r1-Ab RTL 的氨基酸序列。SEQIDN0:15 是 mM0G35-55S45C 变体的氨基酸序列。SEQIDNO: 16是蛋白脂质蛋白(PLP) 139-151的氨基酸序列。SEQIDNO: 17是谷氨酸脱羧酶(GAD) 207-220肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 18是鸡卵溶菌酶(HEL) 11-25肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 19是示例性DP2RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:20是示例性DQ2RTL的氨基酸序列。SEQIDNO: 21-24是示例性MOG肽的氨基酸序列。SEQIDN0:25_30是示例性髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 31是示例性PLP肽的氨基酸序列。SEQIDNO:32-35是示例性胶原II型肽的氨基酸序列。SEQIDNO:36是光间受体视黄类物质结合蛋白(IRBP) 1177-1191肽的氨基酸序列。SEQIDN0:37是抑制蛋白291-310肽的氨基酸序列。SEQ IDNO: 38是光传感因子65-96肽的氨基酸序列。SEQIDN0:39_42是示例性恢复蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDN0:43_46是示例性血纤蛋白原α肽的氨基酸序列。SEQIDΝ0:47_50是示例性波形蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 51是α -烯醇化酶5-21肽的氨基酸序列。SEQIDNO:52是人软骨糖蛋白39259-271肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 53和54是示例性α 2_麦醇溶蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDΝ0:55是示例性DR3RTL的氨基酸序列。SEQIDΝ0:56是示例性DR4RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:57是示例性IAs RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:58是示例性大鼠RTL B RTL的氨基酸序列。
具体实施例方式虽然使用分离的MHC/抗原复合物的概念在治疗和诊断应用中具有很好的前景，但是到目前为止报道的多种方法的主要缺点是所述复合物是大体积的并且因此而难于产生和操作。该方面的一个重大突破是重组T细胞配体或RTL的开发。RTL包含与I类MHC分子或II类MHC分子的肽结合结构域同源的可溶性单链多肽。可将肽装载至抗原结合裂隙，所述RTL-肽复合物可用于若干调节免疫应答方法的任一种。RTL的缺点是，肽仅通过非共价结合相互作用结合至所述抗原裂隙中，因此所述复合物是较不稳定的。已经用抗原决定簇构建RTL，所述抗原决定簇作为所述重组MHC多肽的遗传编码氨基末端延伸而被包括在内。这些复合物是稳定的，然而它们必须被单独设计并且其产生非常耗时。本文公开了组合物，其中所述抗原决定簇通过二硫键与所述RTL多肽(例如β I a IMHC II类RTL多肽或α I a 2MHC I类RTL多肽)共价连接。在β I α I多肽的情况下，所述RTL多肽和所述抗原决定簇之间的二硫键打断了所述β I亚基的内部二硫键。出人意料地，即使当该内部二硫键被打断时，所述RTL仍维持其结构和功能。此外,所述二硫键提供了所述抗原决定簇和所述MHC多肽之间的稳定连接。该稳定相互作用对于旨在给予受试者的药物组合物(不管是维持效力还是效能)，以及满足对该类组合物的监管标准尤其重要。此外，所公开的组合物可通过用选择的抗原决定簇简单地装载RTL来快速且方便地产生，有助于这类组合物的产生和测试。这些组合物也显示出治疗或抑制受试者中疾病或病症(例如自身免疫性疾病)的效能增加。一些肽抗原包含翻译后修饰(例如糖基化或瓜氨酸化)。在人风湿关节炎中，异常免疫应答的关键靶标是已进行瓜氨酸化的蛋白。类似地，已经表明MBP的瓜氨酸化在多发性硬化的病理中起重要作用，病理环境中人MBP上有六个位点被瓜氨酸化。这些经修饰的肽抗原不能在先前描述的RTL (美国专利N0.6，270, 772 ;美国专利公开N0.2005/0142142)的氨基末端被基因编码，本文描述的化学过程可提供对该问题的可行解决方案。抗原决定簇和MHC多肽之间的二硫键的另一优点是，在内化后该键维持直至所述复合物到达内涵体深处，在那里所述抗原决定簇被通过Y干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)切割。然后，所述抗原决定簇可被重新装载到全长(天然)MHC II类分子上以在细胞表面呈递，并且可产生致耐受性应答。1.缩写和术语APC 抗原呈递细胞EAE 实验性自身免疫性脑脊髓炎FACS 荧光激活的细胞分拣GAD 谷氨酸脱羧酶GILT Y干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶HEL 鸡卵溶 菌酶HLA 人白细胞抗原IAA 碘乙酰胺IRBP 光间受体视黄类物质结合蛋白MBP 髓磷脂碱性蛋白MHC 主要组织相容性复合物MOG 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白NOD 非肥胖糖尿病小鼠PLP 蛋白脂质蛋白RTL 重组T细胞受体配体SDS 十_■烧基硫酸纳除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。常用的分子生物学术语的定义可以在牛津大学出版社(Oxford University Press) 1994年出版的Benjamin Lewin的《基因V》(Genes V)，(ISBN0-19-854287-9)) ;Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology), Blackwell Science Ltd.，1994 出版(ISBN0-632-02182-9)和Robert A.Meyers主编的《分子生物学和生物技术:综合案头参考〉〉(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference), VCHPublishers, Inc.，1995 出版(ISBN1-56081-569-8)中找到。为了有助于阅读各个实施方案，提供了以下对一些术语的解释:
β Ια I多肽:以共价键包含MHC II类分子的α I结构域和β I结构域的重组多肽。为了确保合适的构象，这类多肽的取向应使得所述β I结构域的羧基端与所述α I结构域的氨基酸共价连接。在一个非限制性实施方案中，所述多肽是人β I α I多肽，对于人MHC II类分子来说，所述多肽包括α I结构域和β I结构域。人β I α I多肽的一个具体非限制性实例是其中所述β I结构域羧基端与HLA-DR分子的α I结构域的氨基端共价连接的分子。人β I α I多肽的另一个具体非限制性实例是其中所述βI结构域的羧基端与HLA-DR (Α或B)、HLA-DP (A和B)或HLA-DQ (A和B)分子的α I结构域的氨基端共价连接的分子。在一个实施方案中，所述β α I多肽不包括β 2结构域。在另一个实施方案中，所述β I α I多肽不包括α 2结构域。在又一个实施方案中，所述β I α I多肽既不包括α 2结构域也不包括β 2结构域。示例性β I α I多肽被描述于美国专利N0.6，270, 772、美国专利公开 N0.2005/0142142 中，并在本文提供(例如 SEQ ID N0:4、ll、14、19、20 和 55-58)。
β I α I基因:含有编码β I α I多肽的核酸序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，β I α I基因包括可操作地连接到编码β I α I多肽的核酸上的启动子区。在一个实施方案中，所编码的β I α I多肽是人β I α I多肽。α I α 2多肽:以共价键包含MHC I类分子的α I结构域和α 2结构域的多肽。这类多肽的取向应使得所述α I结构域的羧基端与所述α 2结构域的氨基端共价连接。α I α 2多肽包含不完整的I类α链，通常省略所述α链的α 3结构域的大部分或全部。α I α 2多肽的具体非限制性实例是其中α I结构域的羧基端与HLA-A分子、HLA-B分子或HLA-C分子的α 2结构域的氨基端共价连接的多肽。在一个实施方案中，从α I α 2多肽中省略所述α 3结构域，因此所述α I α 2多肽不包括α 3结构域。α I α 2基因:含有编码α I α 2多肽的核酸序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，α I α 2基因包括可操作地连接到编码α α 2多肽的核酸的启动子区。在一个实施方案中，所编码的α I α 2多肽是人α I α 2多肽。抗原:能够在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质,包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的产物。术语“抗原”包括了所有相关的抗原表位和抗原决定簇，例如在本文公开的重组MHC分子的情形中存在的抗原肽。自身免疫性疾病:免疫系统对内源性抗原产生的免疫应答(例如B细胞应答或T细胞应答)且引起组织损伤的疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于:多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、系统性红斑狼疮、恶性贫血、重症肌无力和爱迪生氏病。保守置换或变体:氨基酸残基被具有类似生物化学性质的另外的氨基酸残基置换。肽可以包括一个或多个氨基酸置换，例如1-10个保守置换、2-5个保守置换、4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换。保守置换的具体非限制性实例包括以下实例:
权利要求
1.一种组合物，包含: 含有共价连接的第一结构域和第二结构域的分离的重组MHC多肽和通过二硫键与所述重组MHC多肽的第一结构域共价连接的抗原决定簇，其中: 所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α I结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α 2结构域或β 2结构域；或 所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α 2结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC I类分子不包括α 3结构域。
2.权利要求1的组合物，其中所述二硫键包含所述抗原决定簇中的半胱氨酸残基和所述重组MHC多肽的第一结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键。
3.权利要求2的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域包含βI结构域，所述半胱氨酸残基包含半胱氨酸17、半胱氨酸79或它们的组合。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域和第二结构域之间的共价连接包含肽接头。
5.权利要求4的组合物，其中所述肽接头的长度为至少6个氨基酸。
6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包含肽抗原。
7.权利要求6的组合物，其中所述抗原决定簇包含8-35个氨基酸。
8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包括M0G35-55、胰岛素Β:9-23或PLP139-151。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述抗原决定簇的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，所述重组MHC多肽的第一结构域的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，或者它们的组合。
10.权利要求1-9任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽在溶液中的聚集倾向降低。
11.权利要求10的组合物，其中所述重组MHC多肽包括DR2MHCβ Ia I多肽，所述重组MHC多肽含有一个或多个疏水性残基被极性残基或荷电残基置换，其中所述一个或多个残基选自SEQ ID NO: 11的V102、I104、A106、F108和L110，从而与未改性的重组MHC多肽相比在溶液中的聚集降低。
12.权利要求1-11任一项的组合物，还包含可药用载体。
13.一种治疗或抑制受试者中选自以下的疾病的方法:自身免疫性疾病、视网膜疾病、葡萄膜炎、中风和由药物成瘾引起的认知损伤或神经精神障碍，所述方法包括:给予所述受试者有效量的权利要求1-12任一项的组合物,从而治疗或抑制所述疾病。
14.权利要求13的方法，其中所述自身免疫性疾病选自:多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、系统性红斑狼疮、恶性贫血、重症肌无力、视神经炎和爱迪生氏病。
15.一种治疗或抑制受试者中I型糖尿病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的含有分离的重组MHC多肽以及抗原决定簇的组合物，从而治疗或抑制受试者中的I型糖尿病，所述分离的重组MHC多肽包含共价连接的第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类a I结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α 2结构域或β 2结构域，所述抗原决定簇通过二硫键与所述重组MHC多肽的第一结构域共价连接。
16.权利要求15的方法，其中所述抗原决定簇包含胰岛素。
17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述抗原决定簇包含胰岛素B:9-23或胰岛素 B: 16-23。
18.权利要求17的方法，其中所述胰岛素B:9-23包含SEQID NO: 1、3和7_9中任一个的氨基酸序列。
19.一种产生组合物的方法，所述方法包括: 在足以在抗原决定簇和分离的重组MHC多肽之间形成二硫键的条件下，将所述抗原决定簇与所述重组MHC多肽接触，从而产生所述组合物，所述分离的重组MHC多肽包含共价连接的第一结构域和第二结构域，其中: 所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α I结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α 2结构域或β 2结构域；或 所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α I结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α 2结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC I类分子不包括ci3。
20.权利要求19的方法，其中所述足以形成二硫键的条件包括在将所述抗原决定簇在ρΗ6.5 的 IOOmM NaP04
21.一种用于产生权利要求1的组合物的试剂盒，包括: 重组MHC多肽或编码所述重组MHC多肽的核酸；和 用于提供足以在所述重组MHC多肽和抗原决定簇之间形成二硫键的条件的包含一种或多种组分的溶液。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述溶液包含pH6.5的100mMNaP04、150mM NaCl,0.05%SDS 和 0.01%NaN3。
23.权利要求21或权利要求22的试剂盒，还包含抗原决定簇。
24.由权利要求19的方法产生的组合物。
全文摘要
本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC I类或MHC II类重组体T细胞受体配体RTL多肽的稳定复合物。还公开了制备该组合物的方法和使用方法，例如用于治疗或抑制疾病，例如自身免疫性疾病。
文档编号A61K39/00GK103221424SQ201180052661
公开日2013年7月24日 申请日期2011年9月2日 优先权日2010年9月3日
发明者G·G·伯罗斯 申请人:俄勒冈健康科学大学