专利名称：一种双功能融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种融合蛋白，更特别的，本发明涉及一种包含B7AP与CD40L胞外区的双功能融合蛋白。
背景技术：
T细胞的完全活化及活化之后有效的免疫应答需要两个信号第一信号是TCR与抗原提呈细胞(APC)上的MHC抗原肽复合体的相互作用；第二信号即共刺激信号，由APC的共刺激分子提供，当T细胞只有第一信号而缺乏第二信号，不但不能使之活化，反而会造成T细胞免疫失能，即导致特异性免疫耐受。目前研究最多的共刺激分子是APC上表达的B7分子CD80(B7.1)和CD86(B7.2)及其T细胞上的配体CD28，另一对重要的共刺激分子是CD40-CD40L。共刺激分子的阻断能有效延长同种移植物存活和自身免疫病的治疗。
CTLA4-Ig是第一个显示能够延长同种异体和异种移植物存活的共刺激作用封闭分子。CTLA4-Ig是CTLA4的胞外段与人IgG1Fc段融合形成的融合蛋白。CTLA4-Ig与APC上表达的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的亲和力高于T细胞上表达的CD28与B7.1和B7.2的亲和力。CTLA4-Ig的作用是抑制CD28介导的T细胞共刺激作用。封闭CD40-CD40L途径，也能延长小鼠和灵长类的同种异体移植物存活。在联合CTLA4-Ig和抗CD40L单克隆抗抗体封闭这两种共刺激作用通路实验显示其效果均优于前者。
利用分子模拟技术在设计抗原表位、小分子拮抗剂、配体-受体阻断剂等方面得到广泛应用，并取得了良好的预期结果，在自身免疫、酶学研究和肿瘤治疗药物中取得了满意效果。在配受体相互作用中，含有关键结合残基的短肽能够模拟蛋白质分子的分子结合位点，在多数情况下，结合位点上的几个关键氨基酸残基和配基间的相互作用或识别能量，即能够满足整个蛋白质间相互作用的需要，也就是说，蛋白质间的相互作用的识别是由局部肽段间的相互作用来实现的，由于小分子融合蛋白具有构象柔性所以它甚至具有模拟非线性结合位点的特点。
本发明用计算机分子模拟的方法分析CD28与B7分子的结合位点，并筛选出模拟具有阻断CD28-B7的相互作用的短肽，因其可与B7分子反义互补，称为B7反义肽(B7Antisense Peptide，B7AP)，进而用此反义肽预处理异基因脾细胞免疫受者、诱导低应答状态及异基因嵌合体的形成；根据反义肽的作用效果，构建B7AP与CD40L胞外区(exCD40L)的融合蛋白(B7AP-exCD40L)，并研究其对延长移植物存活的效果和作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于由于T细胞的完全活化及活化之后有效的免疫应答需要两个信号第一信号是TCR与抗原提呈细胞(APC)上的MHC抗原肽复合体的相互作用；第二信号即共刺激信号，由APC的共刺激分子提供，当T细胞只有第一信号而缺乏第二信号，不但不能使之活化，反而会造成T细胞免疫失能，即导致特异性免疫耐受。本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案是提供一种双功能融合蛋白，它包含两个部分，第一部分为模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽(B7AP)，第二部分为小鼠CD40L的胞外区(exCD40L)，两个部分通过接头序列进行连接。
进一步的，本发明所述的模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，小鼠CD40L的胞外区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。第一部分和第二部分通过SEQ ID NO3所示的接头序列进行连接。
本发明的目的还在于提供一种载体，含有SEQ ID NO9所示的碱基序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
本发明的目的还在于提供一种细胞，含有前述的包含SEQ IDNO9所示的基因序列的载体。
本发明的目的还在于提供制备所述的双功能融合蛋白的方法，包含以下步骤1)合成B7AP-linker编码基因；2)将小鼠CD40L胞外区编码基因克隆入pPIC9K质粒，构建pPIC9K-exCD40L质粒；3)将1)获得的编码基因克隆入2)中的pPIC9K-exCD40L质粒，构建pPIC9K-B 7AP-exCD40L质粒；4)将3)获得的pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒转化GS 115 Pichiapastoris，最终用甲醇诱导表达B7AP-exCD40L融合蛋白。
本发明的目的还在于提供一种应用，将本发明所述的双功能融合蛋白应用于制备治疗自身免疫疾病的药物。
本发明的目的还在于提供另一种应用，将本发明所述的双功能融合蛋白应用于制备治疗移植排斥反应的药物。
本发明是一种基于B7/CD40L结合位点新型B7AP-exCD40L融合蛋白，是一种新型共刺激通路拮抗剂。所述的基于B7/CD40L结合位点新型B7AP-exCD40L融合蛋白结构特点是它是一种GS115Pichia pastoris真核表达双功能融合蛋白；其中一个功能域为模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽(EFMYPPPYLD)，由于其与B7.1反义互补，称为B7反义肽(B7AP)，另一个功能域为小鼠CD40L的胞外区(exCD40L)。
本发明所述的基于B7/CD40L结合位点新型B7AP-exCD40L融合蛋白插入了连接序列，在保证了各自功能基团的独立性的同时也有助于形成一定的蛋白结构，获得在体内稳定的融合蛋白。
在体外的小鼠单向混合淋巴细胞反应实验表明，使用本发明的融合蛋白预处理淋巴细胞，可明显降低该淋巴细胞对同种异基因淋巴细胞的刺激增殖作用。
在本发明的一个方面，详细介绍了B7AP-exCD40L融合蛋白的构建、鉴定和表达。包括B7AP-linker基因片段的合成、exCD40L基因的确立与克隆、B7AP-exCD40L融合蛋白表达载体的构建、B7AP-exCD40L融合蛋白的高效表达、以及融合蛋白的鉴定。获得表达浓度高于1mg/ml的B7AP-exCD40L融合蛋白，具体的描述可见实施例1。
在本发明的另一个方面，描述了B7AP-exCD40L融合蛋白对混合淋巴细胞反应的作用。在本试验中，灭活的C57BL/6小鼠脾细胞经过B7AP-exCD40L蛋白溶液预处理后，刺激增殖能力受到了明显的抑制。并且，当B7AP-exCD40L蛋白溶液浓度达到100μg/ml时，抑制率达到59.4％已处于饱和状态，较单独B7AP饱和时抑制率38.4％明显提高。
在本发明的另一个方面，描述了B7AP-exCD40L融合蛋白抑制混合淋巴细胞反应的逆转试验。在本试验设计的几个测试组中，B7AP-exCD40L融合蛋白具有最为明显的阻断CD40-CD40L通路的作用。
在本发明的另一个方面，进一步描述了B7AP-exCD40L上清对B7AP抑制MLR的协同作用。用过量的B7AP预处理灭活的C57BL/6小鼠脾细胞使之对B7的封闭达到饱和，再用B7AP-exCD40L融合蛋白处理此C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞，进行混合淋巴细胞反应(MLR)。结果发现，B7AP+B7AP-exCD40L上清组的抑制效果比B7AP单独作用组更为明显，说明exCD40L部分对抑制效果是起作用的。
在本发明的另一个方面，通过对照试验，证明了B7AP-exCD40L预处理异基因脾细胞对于诱导受鼠特异性免疫失能具有特异性，具体描述在实施例5中。
上述几个方面证明了本发明的融合蛋白在制备治疗自身免疫疾病的药物方面潜在的应用。
进一步的，在本发明的一个方面，描述了B7AP-exCD40L酵母培养上清预处理异基因脾细胞诱导受鼠同种免疫失能与心肌移植存活的作用。结果显示，B7AP-exCD40L预处理异基因灭活的小鼠脾细胞免疫受鼠能诱导受鼠体内产生同种免疫低应答反应而显著延长移植物存活。证明了本发明的融合蛋白在制备治疗移植排斥反应的药物方面的潜在的应用。
在本发明的另一个方面，描述了B7AP-exCD40L预处理小鼠脾细胞诱导异基因嵌合体形成。结果显示，实验组小鼠在BMT后14天同时检测到两种H-2表型的存在，H-2Kd和H-2Kb分别为92.72％和7.02％，表明异基因嵌合体被诱导形成。
在本发明的另一个方面，描述了B7AP-exCD40L诱导异基因嵌合体形成与延长移植物存活。结果嵌合小鼠移植心肌后能够存活达到＞50天。证明了本发明的融合蛋白在制备治疗移植排斥反应的药物方面的潜在的应用。
图1显示了基于B7/CD40L结合位点的B7AP-exCD40L融合蛋白的质粒模式图。
图2显示了转化成功的GS115Pichia pastoris在PCR后进行鉴定，显示在660bp处有明显的条带。
图3显示了B7AP-exCD40L融合蛋白的Western Blot鉴定(a)和Lowry蛋白标准曲线(b)图。
图4显示了B7AP-exCD40L抑制MLR的剂量效应关系。
图5显示了B7AP-exCD40L融合蛋白的抗体中和实验。
图6显示了B7AP-exCD40L上清对B7AP抑制MLR的协同作用。
图7显示了B7AP-exCD40L酵母培养上清预处理异基因小鼠脾细胞诱导特异性免疫失能。
图8显示了B7AP-exCD40L预处理异基因脾细胞诱导延长移植物存活。
图9显示了小鼠异基因嵌合状态的形成与维持，图10a为用流式细胞术检测鼠外周血细胞H-2表型，判定其嵌合状态；图10b为基因嵌合体维持的时间图。
图10显示了B7AP-exCD40L预处理异基因小鼠脾细胞诱导嵌合体与延长移植存活的关系。
具体实施例方式
以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下质粒、菌种、细胞、动物质粒pPIC9K、宿主细菌GS115Pichiapastoris(均购自Invitrogen Corp)。基因合成委托上海博亚公司。6-8周龄雌性BALB/c(H-2Kd)和C57BL/6(H-2Kb)小鼠均购自中科院上海实验动物中心。
分子生物学试剂限制性核酸内切酶EcoR I、Not I、T4DNA连接酶(TaKaRa公司)；T4多核苷酸激酶(Biolab公司)；Taq DNA多聚酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)。
细胞培养、转化试剂细胞培养试剂(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核细胞转染试剂(Invitrogen公司)。
免疫学试剂和材料分子生物学工具酶及主要试剂限制性核酸内切酶EcoR I、Not I、Sal I(TaKaRa公司)；T4DNA连接酶(MBI公司)。D-Biotin、L-Histidine、YNB(Yeast Nitrogen Base W/O AminoAcids)均购自Amresco USA公司。YPD/YEPD(Yeast Extract PeptoneDextrose Medium)液体培养基；MDH/MD(Minimal mediumcontaining glucose and/or histidine)平板；BMGY(Buffered complexmedium containing glycerol)/BMMY(Buffered complex mediumcontaining glycerol)；制备方法严格参照Invitrogen公司产品说明书进行。
蛋白试剂及染料丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，TEMED，透析袋，低分子量蛋白Marker(上海生工公司)，考马斯亮蓝R250(上海化学试剂厂)。
免疫学试剂和材料小鼠CD40L单克隆抗体(Ocogene公司)；HRP标记羊抗兔IgG(ELISA效价1∶5000，华美生物工程有限公司)；戊巴比妥钠(佛山市化学试剂厂)；2ml和1ml无菌注射器(米沙瓦医科工业有限公司)。
实施例1B7AP-exCD40L融合蛋白的构建、鉴定和表达运用分子模拟软件和数据库预测的方法，结合已有的B7-CD28和CD40-CD40L共刺激通路结合位点的相关位点报道，筛选出与B7.1具有相当结合能力反义互补的10肽(EFMYPPPYLD)，选择(GSSSS)3接头序列，并人工合成B7AP-linker编码基因，在其上下游的引入EcoRI酶切位点，下游的AATTC突变为AATTT。根据SWISS-PROT蛋白数据库中mouse CD40L(编号P27548)胞外区编码序列设计PCR引物，上下游引物分别引入EcoR I和Not I酶且位点。RT-PCR克隆出小鼠CD40L胞外区编码基因序列(exCD40L)。选择pPIC9K质粒多克隆位点的EcoR I和Not I双酶切，将前述exCD40L连接构建出pPIC9K-exCD40L质粒。将pPIC9K-exCD40L质粒用EcoR I单酶切，并将合成的B7AP-linker编码基因连接构建出pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒，并测序鉴定。将pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒转化GS115Pichiapastoris，经培养后获得大量菌体，按Invitrogen产品说明书筛选转化重组菌。并用甲醇诱导表达B7AP-exCD40L融合蛋白。用Westernblot鉴定表达的B7AP-exCD40L融合蛋白，并用蛋白扫描和lowry法定量。
1、B7AP-linker基因片段的合成以软件预测结合网络数据库预测后，首先确定了下述多肽序列目的序列B7AP氨基酸序列(SEQ ID NO1)EFMYPPPYLDB7AP DNA序列(SEQ ID NO4)GAGTTCATGTACCCACCACCATACCTGGAC接头(linker)氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO3)Linker DNA序列(SEQ ID NO5)GGAGGTGGAGGGTCGGGAGGTGGCGGATCAGGTGGTGGGGGGTCA为了去掉构建完成的融合蛋白基因中EcoR I的酶切位点，我们特异在基因合成B7AP-Linker过程中把正链的3’端的G突变成C，互补链5’端为GTTAA，使之与EcoR I单酶切的pPIC9K-exCD40L质粒连接后此酶切位点消失，为以后进一步在融合基因的上游再行EcoR I单酶切重复连接几个B7AP-Linker repeats作准备。
引入酶切位点EcoR I和下游突变位点如下正义链(SEQ ID NO10)AATTCGAGTTCATGTACCCACCACCATACCTGGACGGAGGTGGAGGGTCGGGAGGTGGCGGATCAGGTGGTGGGGGGTCAA与正义链互补的反义链(SEQ ID NO11)GCTCAAGTACATGGGTGGTGGTATGGACCTGCCTCCACCTCCCAGCCCTCCACCGCCTAGTCCACCACCCCCCAGTTTTAA2、exCD40L基因的确立与克隆根据网络数据库确立了小鼠CD40L胞外区编码基因如下(SEQ ID NO6)CATAGAAGATTGGATAAGGTCGAAGAGGAAGTAAACCTTCATGAAGATTTTGTATTCATAAAAAAGCTAAAGAGATGCAACAAAGGAGAAGGATCTTTATCCTTGCTGAACTGTGAGGAGATGAGAAGGCAATTTGAAGACCTTGTCAAGGATATAACGTTAAACAAAGAAGAGAAAAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAGAGGTGATGAGGATCCTCAAATTGCAGCACACGTTGTAAGCGAAGCCAACAGTAATGCAGCATCCGTTCTACAGTGGGCCAAGAAAGGATATTATACCATGAAAAGCAACTTGGTAATGCTTGAAAATGGGAAACAGCTGACGGTTAAAAGAGAAGGACTCTATTATGTCTACACTCAAGTCACCTTCTGCTCTAATCGGGAGCCTTCGAGTCAACGCCCATTCATCGTCGGCCTCTGGCTGAAGCCCAGCAGTGGATCTGAGAGAATCTTACTCAAGGCGGCAAATACCCACAGTTCCTCCCAGCTTTGCGAGCAGCAGTCTGTTCACTTGGGCGGAGTGTTTGAATTACAAGCTGGTGCTTCTGTGTTTGTCAACGTGACTGAAGCAAGCCAAGTGATCCACAGAGTTGGCTTCTCATCTTTTGGCTTACTCAAACTC小鼠CD40L的胞外区的氨基酸序列如下(SEQ ID NO2)HRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKL根据上述编码基因，设计RT-PCR引物如表1表1.小鼠CD40L胞外区编码基因引物
用RT-PCR方法，从小鼠胸腺细胞中克隆出小鼠CD40L胞外区编码基因，并测序鉴定。
3、B7AP-exCD40L融合蛋白表达载体的构建pPIC9K是Invitrogen Corp.推出的在Pichia pastoris中分泌型的高效真核表达载体；宿主细菌GS115 Pichia pastoris(InvitrogenCorp.)。将前述的RT-PCR产物连接到pPIC9K质粒中，构建成功pPIC9K-exCD40L质粒，再用EcoR I限制性内切酶切开该质粒，将1中合成的基因连接并构建pPIC9K-B7AP-CD40L质粒(图1)。经PCR及DNA序列测定，插入基因片段与设计相符合。
将所构建的pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒测序鉴定，抽取经pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒转化的酵母染色体DNA，用exCD40L引物进行PCR鉴定，说明经过电转后筛选的阳性克隆酵母染色体DNA已经有目的基因(B7-CD40L)的整合，质粒转化成功。转化成功的GS115Pichia pastoris在PCR后进行鉴定，显示在660bp处有明显的条带(图2)。完整的B7AP-exCD40L融合蛋白的序列见SEQ IDNO9。
4、B7AP-exCD40L融合蛋白的高效表达收集甲醇诱导培养7天的培养上清200ml，1500g离心15min，收集上清，用饱和(NH4)2SO4沉淀。将蛋白质溶液放在另一个装有冰水的大烧杯内，并置于磁力搅拌器上搅拌；边搅拌边徐徐加入硫酸铵至饱和，此步骤在5～10min内完成；继续搅拌10～30min；10000g离心10min；弃上清，将沉淀悬浮于2倍体积的生理盐水中。残留的不溶性杂质通过离心除去；转入透析袋中，放入10倍蛋白质体积的生理盐水中，用磁力搅拌器搅拌以促进达到液体平衡，全过程共更换生理盐水5次；然后浓缩蛋白质，将透析袋放在平皿中，周围覆盖蔗糖，每半小时更换蔗糖一次，2小时后，蛋白质溶液浓缩到约5ml，用无菌的Eppendorf管分装，置-70℃冷冻保存备用。
5、B7AP-exCD40L融合蛋白的鉴定按常规配制10％的分离胶，6％的浓缩胶，将样品于沸水中煮5min后加样。电泳起始电压50V，待样品进入分离胶后调整电压为90V。当溴酚蓝指示剂到达底部时停止电泳。分离电泳胶后，凝胶置于5倍体积的染色液中室温振摇染色5小时。染色完成后置于5倍体积的脱色液中摇动脱色5小时，期间换液3次直至条带清晰可见、背景颜色很浅为止，取出后拍照保存。染色后凝胶置于天能凝胶成相仪中，经过扫描相对定量。Western blot参照相关文献(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)进行。样品经15％SDS-PAGE分离。电泳后，采用半干法(20V，1h)转移到硝酸纤维素膜上。经封闭液(0.01M pH7.4，PBS，5％lipid-free milk powder)封闭后，先后用以封闭液稀释的特异性抗体和HRP偶联的二抗杂交。加底物(25mg DAB溶于10ml甲醇，然后加PBS-0.3％Tween-20至100，再加30％H2O230μl 37℃显色20min观察结果。Lowry检测法是一种的比较常用的微量蛋白质定量检测方法。具体操作用双蒸水稀释样品至0.5ml，加入2.5ml溶液C(溶液A与溶液B 1∶50V/V混合；溶液A0.5％CuSO4.5H2O，1％Na3C6H5O7.2H20；溶液B20G/l Na2CO3，4g/L NaOH)，混匀在室温下放置10min，加0.25ml溶液D(Folin-酚试剂与双蒸水等体积混合)，30min后，再分光光度计上测A750值。同时作标准曲线和待测样品，均用双复孔。结果见图3，表达菌在约27kDa(DNAstar软件分析结果B7AP-exCD40L融合蛋白MW26731.25)处有一个浓集的条带，而仅转入空载体的对照菌未见此条带，诱导后3、4天培养上清电泳，半干转移至硝酸纤维素膜，以5％脱脂牛奶封闭，然后依次与兔抗小鼠CD40L抗血清、羊抗兔IgG-HRP酶标抗体孵育，最后在DAB/H2O2下显色，在膜相当于表达条带出出现特异性着色，证明表达条带具有小鼠CD40L的免疫反应性。测定培养上清的总蛋白浓度(3.5mG/ml)，扫描确定B7AP-exCD40L所占的比例为33.3％，计算表明B7AP-exCD40L表达浓度为1.166mg/ml。
实施例2 B7AP-exCD40L融合蛋白对混合淋巴细胞反应的作用为观察B7AP-exCD40L融合蛋白预处理灭活的C57BL/6小鼠脾细胞对异基因的BALB/c小鼠脾细胞的刺激增殖的影响，分别用10、100、1000μg/ml的B7AP-exCD40L蛋白溶液预处理灭活的C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞(stimulator cell)，用生理盐水(NS)预处理组作阴性对照，与新鲜制备的BALB/c小鼠脾细胞作MLR(图4)。随着B7AP-exCD40L蛋白溶液浓度的增加，CPM值相应下降，说明灭活的C57BL/6小鼠脾细胞经过B7AP-exCD40L蛋白溶液预处理后，刺激增殖能力受到明显抑制。
经过统计分析，100μg/ml组与1000μg/ml组无显著性差异(P＜0.01)；提示当B7AP-exCD40L蛋白溶液浓度达到100μg/ml时已处于饱和状态，此时得抑制率达到59.4％，较单独B7AP饱和时抑制率38.4％明显提高。但为了充分保证封闭效果，选择1000μg/mlB7AP-exCD40L蛋白为以后实验的工作浓度。
实施例3 B7AP-exCD40L融合蛋白抑制混合淋巴细胞反应的逆转试验B7AP-exCD40L融合蛋白预处理灭活的C57BL/6小鼠脾细胞对BALB/c小鼠脾细胞的刺激作用受到明显抑制，为证实该融合蛋白具有阻断CD40-CD40L通路的作用设计了下面实验；比较生理盐水组(NS)、B7AP-exCD40L上清、B7AP-exCD40L上清+CD40L抗体、空质粒上清和B7AP对照组对上述抑制MLR作用的效果(图5)。从图中可以看出，B7AP-exCD40L融合蛋白组较生理盐水组有明显抑制效果，当用CD40L抗体预处理B7AP-exCD40L融合蛋白，离心后取其上清预处理C57BL/6小鼠脾细胞，抑制MLR的效果即消失，表明正是B7AP-exCD40L融合蛋白发挥了此种抑制作用；为了排除酵母培养上清及pPIC9K质粒对此抑制效果的可能影响，设置了pPIC9K空质粒对照组，统计分析表明，这一组与生理盐水组没有显著性差异(P＞0.05)，说明pPIC9K空质粒酵母表达上清并不显示出抑制作用。B7AP组结果与以前结果相似，且抑制率低于B7AP-exCD40L融合蛋白组。
实施例4 B7AP-exCD40L上清对B7AP抑制MLR的协同作用为进一步证实B7AP-exCD40L融合蛋白中的exCD40L部分对前述抑制效果的作用，先用过量的B7AP预处理灭活的C57BL/6小鼠脾细胞使之对B7的封闭达到饱和，再用B7AP-exCD40L融合蛋白处理此C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞，进行MLR，观察此融合蛋白对B7和CD40的封闭作用，结果见图6，B7AP+B7AP-exCD40L上清组抑制效果比B7AP单独作用组更为明显，说明exCD40L部分对抑制效果是起作用的；进一步提示阻断CD40-CD40L在诱导免疫失能中的作用。
实施例5 B7AP-exCD40L预处理异基因脾细胞诱导受鼠特异性免疫失能的特异性(再次应答)为了检测B7AP-exCD40L预处理的灭活的C57BL/6脾细胞免疫受者BALB/c小鼠能否在其体内诱导免疫失能的特异性，在受鼠被免疫3天后，取其脾脏制备脾细胞悬液作为应答细胞(B7AP-exCD40L组)，分别用新鲜制备并灭活的C57BL/6和C3H/HeJ脾细胞作为刺激细胞进行混合淋巴细胞反应，应答细胞同时设置生理盐水(NS)对照组，在混合培养的第5天检测增殖效果(图7)，B7AP-exCD40L组CPM值仅为NS组的31.8％，提示B7AP-exCD40L预处理异基因灭活的小鼠脾细胞免疫的受鼠体内诱导了免疫失能；而灭活的C3H/HeJ脾细胞对免疫受鼠脾细胞却呈现很强的增殖应答反应，与C57BL/6小鼠脾细胞刺激诱发的增殖反应有显著性差异(P＜0.001，n＝6)，说明上述免疫失能状态具有特异性。
实施例6 B7AP-exCD40L酵母培养上清预处理异基因脾细胞诱导受鼠同种免疫失能与心肌移植存活的作用以B7AP-exCD40L预处理灭活的异基因小鼠脾细胞免疫受者，接种新生的C57BL/6鼠的心肌移植物；同时对受者小鼠设置了下列对照组，阳性对照阿霉素对照组(Adr)；阴性对照生理盐水(NS)；实验结果见图8。B7AP-exCD40L预处理的脾细胞免疫组心肌平均存活期20.3天；阿霉素组为17天，NS组平均存活＜4天；说明已经排斥死亡(加速排斥反应)；B7AP-exCD40L预处理脾细胞免疫组与NS组相比，移植物存活显著延长，二者具有极显著性差异(Kaplan-MeierLog ranktest χ2＝55.81 υ＝4P＜0.0001 n＝6)。以上结果说明，B7AP-exCD40L预处理异基因灭活的小鼠脾细胞免疫受鼠能诱导受鼠体内产生同种免疫低应答反应而显著延长移植物存活。
实施例7 B7AP-exCD40L预处理小鼠脾细胞诱导异基因嵌合体形成经B7AP-exCD40L预处理异基因小鼠脾细胞免疫受鼠3天后，输注新鲜的供鼠(C57BL/6)骨髓细胞(每只2×107/100μl)，2周后用流式细胞术检测其外周血细胞H-2表型判定嵌合状态。结果(图9a)显示实验组小鼠在BMT后14天同时检测到两种H-2表型的存在，H-2Kd和H-2Kb分别为92.72％和7.02％，表明异基因嵌合体被诱导形成。在随后的21、50天嵌合状态仍持续存在(n＝6)，见图9b。实施例8B7AP-exCD40L诱导异基因嵌合体形成与延长移植物存活给嵌合率＞2％的受鼠在第7天移植C57BL/6小鼠的心肌，动态观察移植心肌的存活情况。结果表明在嵌合小鼠移植心肌能够存活达到＞50天(n＝6)，较对照组阿霉素和未用B7AP处理组明显延长(P＜0.0001)，见图10。
序列表<110>申请人复旦大学<120>一种双功能融合蛋白<160>11<170>Patent In version 3.0<210>1<211>10<212>PRT<213>人工合成<400>1Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp15 10<210>2<211>214<212>PRT<213>小鼠CD40L的胞外区<400>2His Arg Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val15 10 15
Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser Leu Leu20 25 30 35Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys Asp Ile Thr Leu40 45 50Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Arg Gly Asp Glu Asp55 60 65 70Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val75 80 8590Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu95 100 105Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr110 115 120 125Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val130 135 140Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala145 150 155 160Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly Gly165 170 175180Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Glu Ala Ser185 190 195Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu200 205 210<210>3<211>15<212>PRT<213>人工合成
<400>3Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15<210>4<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>4gagttcatgt acccaccacc atacctggac 30<210>5<211>45<212>DNA<213>人工合成<400>5ggaggtggag ggtcgggagg tggcggatca ggtggtgggg ggtca45<210>6<211>642<212>DNA<213>鼠<400>6
catagaagat tggataaggt cgaagaggaa gtaaaccttc atgaagattt tgtattcata60aaaaagctaa agagatgcaa caaaggagaa ggatctttat ccttgctgaa ctgtgaggag120atgagaaggc aatttgaaga ccttgtcaag gatataacgt taaacaaaga agagaaaaaa180gaaaacagct ttgaaatgca aagaggtgat gaggatcctc aaattgcagc acacgttgta240agcgaagcca acagtaatgc agcatccgtt ctacagtggg ccaagaaagg atattatacc300atgaaaagca acttggtaat gcttgaaaat gggaaacagc tgacggttaa aagagaagga360ctctattatg tctacactca agtcaccttc tgctctaatc gggagccttc gagtcaacgc420ccattcatcg tcggcctctg gctgaagccc agcagtggat ctgagagaat cttactcaag480gcggcaaata cccacagttc ctcccagctt tgcgagcagc agtctgttca cttgggcgga540gtgtttgaat tacaagctgg tgcttctgtg tttgtcaacg tgactgaagc aagccaagtg600atccacagag ttggcttctc atcttttggc ttactcaaac tc 642<210>7<211>36<212>DNA引物<213>人工合成<400>7ataagaatgc ggccgcgagt ttgagtaagc caaaag 36<210>8<211>28<212>DNA引物<213>人工合成
<400>8cggaattcca tagaagattg gataaggt 28<210>9<211>723<212>DNA<213>人工合成<400>9gagttcatgt acccaccacc atacctggac ggaggtggag ggtcgggagg tggcggatca60ggtggtgggg ggtcacaatt ccatagaaga ttggataagg tcgaagagga agtaaacctt120catgaagatt ttgtattcat aaaaaagcta aagagatgca acaaaggaga aggatcttta180tccttgctga actgtgagga gatgagaagg caatttgaag accttgtcaa ggatataacg240ttaaacaaag aagagaaaaa agaaaacagc tttgaaatgc aaagaggtga tgaggatcct300caaattgcag cacacgttgt aagcgaagcc aacagtaatg cagcatccgt tctacagtgg360gccaagaaag gatattatac catgaaaagc aacttggtaa tgcttgaaaa tgggaaacag420ctgacggtta aaagagaagg actctattat gtctacactc aagtcacctt ctgctctaat480cgggagcctt cgagtcaacg cccattcatc gtcggcctct ggctgaagcc cagcagtgga540tctgagagaa tcttactcaa ggcggcaaat acccacagtt cctcccagct ttgcgagcag600cagtctgttc acttgggcgg agtgtttgaa ttacaagctg gtgcttctgt gtttgtcaac660gtgactgaag caagccaagt gatccacaga gttggcttct catcttttgg cttactcaaa720ctc 723
<210>10<211>81<212>DNA<213>人工合成<400>10aattcgagtt catgtaccca ccaccatacc tggacggagg tggagggtcg ggaggtggcg60gatcaggtgg tggggggtca a 81<210>11<211>81<212>DNA<213>人工合成<400>11gctcaagtac atgggtggtg gtatggacct gcctccacct cccagccctc caccgcctag60tccaccaccc cccagtttta a 8权利要求
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，包含两个部分，第一部分为模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽，第二部分为小鼠CD40L的胞外区，两个部分通过接头序列进行连接。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，小鼠CD40L的胞外区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的双功能融合蛋白，其特征在于，第一部分和第二部分通过SEQ ID NO3所示的接头序列进行连接。
4.一种载体，其特征在于，含有SEQ ID NO9所示的碱基序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
5.一种细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的载体。
6.制备权利要求1所述的双功能融合蛋白的方法，其特征在于，包含以下步骤1)合成B7AP-linker编码基因；2)将小鼠CD40L胞外区编码基因克隆入pPIC9K质粒，构建pPIC9K-exCD40L质粒；3)将1)获得的编码基因克隆入2)中的pPIC9K-exCD40L质粒，构建pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒；4)将3)获得的pPIC9K-B7AP-exCD40L质粒转化GS115 Pichiapastoris，最终用甲醇诱导表达B7AP-exCD40L融合蛋白。
7.权利要求1所述的双功能融合蛋白在制备治疗自身免疫疾病的药物方面的应用。
8.权利要求1所述的双功能融合蛋白在制备治疗移植排斥反应的药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，公开了一种双功能融合蛋白，它包含两个部分，第一部分为模拟小鼠CD28上与B7.1结合位点的短肽，第二部分为小鼠CD40L的胞外区，两个部分通过接头序列进行连接。本发明还公开了含有编码所述双功能融合蛋白基因的载体和细胞。本发明还公开了所述的双功能融合蛋白的应用。
文档编号A61P37/02GK1817909SQ200510023960
公开日2006年8月16日 申请日期2005年2月8日 优先权日2005年2月8日
发明者熊思东, 陈晋, 储以微, 王缨 申请人:复旦大学