one-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1 (含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl，pH = 8. 0)洗脱，收集 洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2 (含IOOmM谷胱甘肽）洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE 鉴定纯化产物【图4】。
[0034] 4.兔抗MZFl抗血清的制备
[0035] 以纯化的GST-MZFl融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋 白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离 血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-MZFl融合 蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。 于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到I : 100 000时， 颈动脉放血，收集血清。
[0036] 5. ProteinA/G 纯化抗 MZFl 血清
[0037] 将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血 清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后， 加 PH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体 的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色 结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。
[0038] 实施例2: GST-MZFl抗体的分析及应用
[0039] I. GST-MZFl抗体效价的测定
[0040] 用GST-MZFl融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的 GST-MZFl抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示，免 疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-MZFl的抗体，GST-MZFl抗体的滴度高达1 : 100 000 以上【图6】。
[0041] 2. GST-MZFl抗体应用于细胞中MZFl蛋白的检测
[0042] 收集培养的前列腺癌细胞LNCaP和正常细胞293T，裂解超声后用BCA蛋白定量 试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜 上。以5%脱脂奶粉封闭lh，依次滴加兔抗MZFl抗体（室温2h、PBS洗3次）及山羊抗兔 IgG2HRP(室温反应lh、PBS洗涤3次），最后加底物DAB显色，并拍照。结果显示【图7】， 我们制备的MZFl抗体与LNCaP和293T细胞株中所表达的MFl蛋白都发生了抗原-抗体反 应，在Marker指示的80KD处出现了一条特异的蛋白带，并且在不同的细胞株中特异蛋白带 的表达强度有所不同，293T细胞的特异蛋白带强度高，证明293T细胞高表达MZFl。
【主权项】
1. 利用GST表达体系制备的MZFl-N端抗体，其特征在于利用GST表达体系以MZFl蛋 白N端128个氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-MZFl融合蛋白作为抗原免疫动 物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-MZFl抗体的滴度高达1 : 100000,并经过Western blot鉴定该抗GST-MZFl血清具有较好的特异性，其中， N端128个氨基酸序列为：2. 如权利要求1所述的原核表达GST-MZFl融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征 在于利用GST表达系统获得GST-MZFl融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-MZFl抗血清，具体 包括四步： 第一步，PCR-PMD18-T/GST-MZF1重组质粒的构建，MZFl基因 N-128片段从Genebank 得到，基因序列号为NM003422,以pcCDNA3. I-Flag-MZFl为模板，上游引物为5'-GAATCC ATGAGG CCTGCG GTGCTG(含 EcoRI 酶切位点）；下游引物为 5'-CTCGAG CTATCC GCCCGG CTCCCG (含XhoI酶切位点），扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受 态大肠杆菌DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以 EcoR I，Xhol I单酶切鉴定； 第二步，原核表达载体PGEX-4T-1的构建，将含有MZFl基因 N-128片段的pMD18-T质 粒EcoR I和Xhol双酶切后，利用回收试剂盒获得MZFl基因 N-128片段，同时用相同的 酶处理质粒PGEX-4T-1，然后将回收的MZFl基因 N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-l在 T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定； 第三步，GST-MZFl融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆 菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中，37°C振摇培养过夜，次日，将培养物按1 : 50 的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37°C摇床培养至对数生长中期，在培养液的 A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终浓度为0. 08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置 25°C继续培养4~5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-MZFl融合蛋白的表达， 并优化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4°C离心5min,收集菌体，用60mL 冰预冷的NETN悬浮IL菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4°C离心15min， 取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、 50mM TriScl，pH=8.0,洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2,含IOOmM谷胱甘肽，洗 两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物； 第四步，兔抗MZFl抗血清的制备及纯化，以纯化的MZFl融合蛋白免疫雄性新西兰大 白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下 多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免 疫，500 μ g纯化的GST-MZFl融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注 射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价， 当抗体效价达到1 : 100000时，颈动脉放血，收集血清，将ProteinA/G sepharose CL-4B 填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即 亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加 pH2. 7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗 脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的 抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定； 第五步，MZFl抗体的免疫学检测，用GST-MZFl融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清 作为对照，将纯化后的GST-MZFl抗体先稀释10倍再倍比稀释后，采用间接ELISA方法 测定抗体的效价，并采用Western blot方法分析抗MZFl血清特异性，将纯化的融合蛋白 GST-MZFl样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭lh， 依次滴加兔抗鼠 MZFl抗血清，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应lh、PBS洗 涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的MZF1抗体及应用。利用基因工程技术，将MZF1基因克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-MZF1融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western？blot检测。该抗MZF1多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中MZF1蛋白的检测并能有效检出MZF1蛋白在不同细胞中的差异表达，对于系统研究MZF1蛋白功能意义重大。
【IPC分类】C07K16/06, C07K16/18, C12N15/70, C07K1/16, C07K19/00
【公开号】CN105061595
【申请号】CN201510457882
【发明人】李晓萌, 孙佳昕, 赵兵, 杨柳, 李江
【申请人】东北师范大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月30日