一种戊唑醇人工抗原的合成方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人工抗原，具体的说是一种戊唑醇人工抗原的合成方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 戊唑醇（Tebuconazole，CAS 107534-96-3)，化学名：（RS)-I-对氯苯基-4, 4-二 甲基-3-(1Η-1，2, 4-三唑-1-基甲基）戊-3-醇，为一种三唑类杀菌剂，是德国拜耳公司于 1986年开发的，具有高效、广谱、低毒和持效期长的优势，其杀菌机理是破坏和阻止麦角甾 醇的生物合成，导致病原菌因不能形成细胞膜而致死。它可以在植物组织内部转移，从而既 可以杀死植物表面的病菌，也可以杀死植物内部的病菌。在农业上普遍用于防治白粉病、黑 穗病、纹枯病、全蚀病、云纹病、锈病、菌核病、叶斑病、斑点落叶病、灰霉病等病害。但是，戊 唑醇农药对肝脏与血液系统有一定的蓄积毒性，还可能是一种非遗传毒性的动物致癌物。 戊挫醇对大鼠的急性经口半数致死量（median lethal dose，LD50)约为4000 mg/kg，对雌、 雄小鼠的急性经口 LD50分别为3933和2000 mg/kg，对大鼠的急性经皮LD50>5000 mg/kg。 因此，戊唑醇农药在农产品、水体及土壤环境中的残留问题受到越来越广泛的关注。
[0003] 目前，检测戊唑醇农药常用方法有气相色谱法和高效液相色谱法，但这些方法均 存在检测成本高和样品前处理繁琐，尤其不适用于现场的快速检测。随着免疫分析技术的 不断发展，酶联免疫分析法现已开始用于检测三唑类杀菌剂农药，具有操作简单、经济和高 通量的优势。然而，建立戊唑醇农药酶联免疫分析法的关键在于抗原的设计与合成。到目 前为止，国内尚没有针对戊唑醇农药抗原合成和抗体制备的有关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供了一种新型的人工抗原制备方 法，合成了针对戊唑醇农药残留检测的完全抗原，为国内农产品中戊唑醇农药的免疫分析 检测提供技术支撑。
[0005] -种戊唑醇人工抗原的合成方法，所述戊唑醇人工抗原包括免疫原和包被原，其 合成方法包括以下步骤： 步骤一、将戊唑醇采用羧基二咪唑法和牛血清白蛋白偶联，得到戊唑醇免疫原混合液， 反应如下：
将戊唑醇采用碳二亚胺法和鸡卵清蛋白偶联，得到戊唑醇包被原混合液，反应如下：
步骤二、戊唑醇人工抗原的纯化 采用透析法分别对到戊唑醇免疫原混合液和戊唑醇包被原混合液，进行脱盐纯化，得 到免疫原和包被原，即为戊唑醇人工抗原混合液。
[0006] 该步骤可以采用以下操作方法：称取0. 025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑 醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二甲基甲酰胺（DMF)，搅拌，溶解得到A液；准确称量N， Ν' 一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2, 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中搅拌，反 应30 min，反应结束时，溶液无色透明，得到B液；称取20 mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于 4. 5 mL pH 8. 8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液。在冰浴下，将B液逐滴滴加到C液中，反应4 h，得到戊唑醇免疫原混合液； 称取0.025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二 甲基甲酰胺（DMF)，搅拌，溶解得到A液；准确称量Ν，Ν'一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2， 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中搅拌，反应30 min，反应结束时，溶液无色透明， 得到B液；称取28 mg的鸡卵清蛋白溶于4. 5 mL pH 8. 8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液。在 冰浴下，将B液逐滴滴加到C液中，反应4 h，得到戊唑醇包被原混合液； 步骤二、戊唑醇人工抗原的纯化 采用透析法对戊唑醇人工抗原混合液进行脱盐纯化，即得到戊唑醇人工抗原。
[0007] 该步骤的具体操作方法，所述步骤二的具体操作方法为，分别将戊唑醇包被原混 合液和戊唑醇包被原混合液移入处理过的透析袋中，用0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸盐缓冲 液透析，更换透析外液6-8次，分别除去戊唑醇免疫原和包被原，即戊唑醇人工抗原，分别 对其进行分装和保存。
[0008] 步骤三、戊唑醇人工抗原的鉴定 首先，采用考马斯亮蓝染色法对戊唑醇人工抗原的蛋白浓度进行估算；对牛血清白蛋 白的浓度及其对应的吸光值采用origins. 5软件进行线性回归，再根据线性回归方程和稀 释倍数计算可得所制备的戊唑醇人工抗原的蛋白浓度3. 2 mg/mL。
[0009] 其次，根据戊唑醇在220nm的吸光值，计算其摩尔吸光系数。
[0010] 最后，测定200 mg/mL的牛血清白蛋白和戊唑醇人工抗原在220nm下的吸光值，根 据上述公式估算出戊唑醇免疫原的偶联比15 :1，两种免疫原分子比为8-25,可取得良好的 免疫效果。
[0011] 所制备戊唑醇人工抗原可以应用于戊唑醇农药残留检测。
[0012] 有益效果是： 1、本发明成功合成了戊唑醇的人工抗原，合成步骤简单，有效，用该抗原可以制备出满 足国内需求的戊唑醇抗体，并可以利用该抗体建立检测戊唑醇的各种免疫分析方法，为以 后人们的研究提供了试验原料和简便的方法。
[0013] 2、提供一种戊唑醇人工抗原的合成方法，所制备的产品用于建立检测戊唑醇的免 疫分析方法，为今后的研究提供了一种新型的人工抗原制备方法。为此，本专利设计并合成 了针对戊唑醇农药残留检测的完全抗原，为国内农产品中戊唑醇农药的免疫分析检测提供 技术支撑，还可以用于制备检测戊唑醇农药残留的酶联免疫试剂盒。
【附图说明】
[0014] 图1是利用间接ELISA方法测定戊唑醇农药的标准抑制曲线图； 图2是戊唑醇抗体的亲和常数测定图。
【具体实施方式】
[0015] -种戊唑醇人工抗原的合成方法，所述戊唑醇人工抗原包括免疫原和包被原，其 合成方法包括以下步骤： 步骤一、将戊唑醇采用羧基二咪唑法和牛血清白蛋白偶联，得到戊唑醇免疫原混合液， 反应如下：
步骤二、戊唑醇人工抗原的纯化 采用透析法分别对到戊唑醇免疫原混合液和戊唑醇包被原混合液，进行脱盐纯化，得 到免疫原和包被原，即为戊唑醇人工抗原混合液。
[0016] 该步骤可以采用以下操作方法：称取0. 025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑 醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二甲基甲酰胺（DMF)，搅拌，溶解得到A液；准确称量N， Ν' 一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2, 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中搅拌，反 应30 min，反应结束时，溶液无色透明，得到B液；称取20 mg的牛血清白蛋白（BSA)溶于 4. 5 mL pH 8. 8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液。在冰浴下，将B液逐滴滴加到C液中，反应4 h，得到戊唑醇免疫原混合液； 称取0.025 mmol (分子量307. 8, 7. 7 mg)的戊唑醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二 甲基甲酰胺（DMF)，搅拌，溶解得到A液；准确称量Ν，Ν'一羧基二咪唑0.2 mmol (Mw 162. 2， 32. 5 mg)加入到A液中，在37°C的水浴中搅拌，反应30 min，反应结束时，溶液无色透明， 得到B液；称取28 mg的鸡卵清蛋白溶于4. 5 mL pH 8. 8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液。在 冰浴下，将B液逐滴滴加到C液中，反应4 h，得到戊唑醇包被原混合液； 步骤二、戊唑醇人工抗原的纯化 采用透析法对戊唑醇人工抗原混合液进行脱盐纯化，即得到戊唑醇人工抗原。
[0017] 该步骤的具体操作方法，所述步骤二的具体操作方法为，新的透析袋先蒸馏水中 煮15min左右，分别将戊唑醇包被原混合液和戊唑醇包被原混合液移入处理过的透析袋 中，用0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸盐缓冲液透析，更换透析外液6-8次，每隔8 h更换一次 透析液，分别除去戊唑醇免疫原和包被原，即戊唑醇人工抗原，分别对其进行分装和保存。
[0018] 步骤三、戊唑醇人工抗原的鉴定 偶联比测定：本专利采用紫外分光光度法对抗原中被偶联两种分子的比率进行估算， 原理是基于物质对光的吸收与其浓度呈比例关系来分别测定被偶联的两种分子浓度，并且 蛋白质和戊唑醇均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加和偏移的性质进行计 算。
[0019] 采用考马斯亮蓝染色法测定偶联物的蛋白浓度：采用20%甲醇磷酸盐缓冲溶液， 配制lmg/mL的牛血清白蛋白标准溶