液，然后再将其浓度依次稀释为0,40,60,80,100 μ g/ mL，在酶标板孔内分别加入不同浓度的牛血清白蛋白溶液48 mL，接着加入240 mL考马斯亮 蓝染色液，在酶标仪上震荡，5 min后进行测定，每个浓度做5个平行，在595 nm处测吸光 值，以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，以其对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。然后将抗 原溶液按一定比例稀释，按照相同的方法在595 nm处测定抗原溶液的吸光值，依据蛋白质 标准曲线的回归方程和稀释倍数得到抗原溶液的蛋白浓度3. 2 mg/mL。
[0020] 摩尔吸收系数ε :配制戊唑醇浓度为〇, 25, 50, 75,100 μ g/mL的甲醇溶液，在波 长200-600 nm下进行紫外扫描，由扫描结果可知，戊唑醇的最大吸收波长在225 nm和262 nm，选择220 nm处测吸光值，每个浓度做5个平行样，摩尔吸光系数计算为：ε =吸光值/摩 尔浓度。
[0021] 偶联比测定：配制200 μ g/mL牛血清蛋白的20%甲醇溶液，将抗原用20%甲醇磷 酸盐缓冲溶液稀释蛋白浓度为200 μ g/mL，在220 nm处测吸光值，以20%甲醇为空白，测出 的吸光值为 A1、A2,偶联比 r 为：r=((A2-Al) / ε V(20(T 10 3/67000) 其中￡为摩尔吸光系数（17111〇1)，67000为牛血清蛋白的分子量，200\103为牛血清蛋 白浓度（μ g/mL)，计算偶联比率r为15:1。
[0022] 采用本发明所制备的戊唑醇人工抗原制备抗体及其抗体检测： 所制备的抗体的亲和常数为5. 21' IO5 L/mol，半数抑制浓度（IC50)为17. 86 ±1. 45 ng/mL，检测限为3. 63 ng/mL，与三唑醇、三唑酮、稀挫醇的交叉反应率低于10% ;按照如下 步骤进行操作： 步骤一、动物免疫：选择1. 5-2. 0 kg的新西兰大白兔(购自河南科技大学医学部）为试 验动物，购买的试验动物先适应环境一周，然后开始试验；每2只新西兰兔子为一组，共3 组；免疫原由戊唑醇和牛血清白蛋白通过羧基二咪唑法相偶联；将完全氟氏佐剂和免疫原 按照1:1体积比进行乳化，采用背部多点注射的方式进行免疫，新西兰大白兔的初免剂量 Img/只（以蛋白含量计算)，首免后四周进行加强免，加强免之间间隔2周，加强免剂量0.65 mg/只。
[0023] 步骤二、抗血清的制备和筛选：四次免疫后7-10天，通过耳廓外缘静脉进行采血， 先移到37° C的培养箱中放置30 min,再转到4° C冰箱中放置4 h，离心（5000 rpm，10 min)，获得抗血清。采用间接竞争酶联免疫法测定抗血清的效价和抑制，选择效价高并抑制 好的兔子采用心脏采血方式进行采血，收集于50 mL灭菌塑料离心管中，按照上述同样的方 法制备抗血清。
[0024] 步骤三、抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化血清，得到抗戊唑醇的多克隆抗体，加入等体积的甘油， 分装，-20°C下保存，备用。
[0025] 步骤四、灵敏度的测定 采用间接竞争酶联免疫法（i c-ELI SA)测定抗体对戊唑醇农药的抑制效果，选择包被原 浓度为〇. 4 mg/mL，抗体的蛋白浓度为0. 05 mg/mL，测定结果用origin 8. 5软件进行四参 数回归拟合，结果见图1。根据拟合的回归方程，计算抗体IC50为17. 86±1. 45 ng/mL ;标 准曲线的线性范围在0-200 ng/mL之间；检测限达到了 3.63 ng/mL。
[0026] 步骤五、特异性的测定 采用间接竞争酶联免疫法测定多克隆抗体对其类似物(三唑醇、三唑酮、烯唑醇、腈菌 唑和联苯三唑醇）的抑制作用，每个试验做5次重复。根据测定结果用origin 8. 5软件进 行四参数回归拟合，根据拟合的回归方程计算抗体对各种类似物的半?数抑制浓度，根据下 式计算各种类似物的交叉反应率，结果见表1。
[0027] 交叉反应率（CR，％)= IC50 (戊唑醇）/ IC50 (戊唑醇类似物） 表1戊唑醇抗体的交叉反应结果
步骤六、亲和常数的测定 包被原从I mg/mL开始倍比稀?释6个不同的浓度进行测定，每个孔做五次平行；抗 体从I mg/mL开始倍比稀释8个浓度，采用间接竞争酶联免疫方法测定多克隆抗体（pAb)的 效价；然后以多克隆抗体浓度（pAb浓度，ng/mL)对数值为横坐标，以Abs (450nm)为纵坐 标在origin 8. 5软件中绘制出6条曲线，根据绘制曲线计算出Abs (450nm)抑制50%时对 应的抗体浓度，换算抗体浓度的单位mol/L，然后两两一组，根据下式计算亲和常数（Ka) Ka=(n_l)/2(n[Ab' ]t_[Ab]t) 其中，η为2个包被浓度的比值(大于I) ;[Ab' ]t和[Ab]t分别为对应Abs (450nm) 抑制一半时对应的抗体浓度（mol/L)。
[0028] 根据图2的测定结果，计算出抗体的亲和常数为5. 2Γ IO5 L/mol。
[0029] 本发明所述试剂均可通过市场购买得到； 所述pH 8.8的硼酸盐缓冲溶液的组成成份为，每IL硼酸盐缓冲溶液中含硼砂 13. 349g，硼酸3. 711g，余量为水。
[0030] 所述0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸盐缓冲液的组成成份为，每IL磷酸盐缓冲液中 含磷酸二氢钠〇. 296 g ;磷酸氢二钠2. 9g ;氯化钠：9g ;氢氧化钠：0. 16 g，余量为水。
【主权项】
1. 一种戊唑醇人工抗原的合成方法，其特征在于：所述戊唑醇人工抗原包括免疫原和 包被原，其合成方法包括以下步骤： 步骤一、将戊唑醇采用羧基二咪唑法和牛血清白蛋白偶联，得到戊唑醇免疫原混合液， 反应如下：步骤二、戊唑醇人工抗原的纯化采用透析法分别对到戊唑醇免疫原混合液和戊唑醇包被原混合液，进行脱盐纯化，得 到免疫原和包被原，即为戊唑醇人工抗原混合液。2. 如权利要求1所述的戊唑醇人工抗原的合成方法，其特征在于： 所述步骤一的具体操作方法为，称取〇. 025 mmol的戊唑醇，向其中加入0. 5 mL的N， Ν' 一二甲基甲酰胺，搅拌，溶解得到A液；取N，N' 一羧基二咪唑0.2 mmol加入到A液中， 在37°C的水浴中搅拌，反应30 min，反应结束时，溶液无色透明，得到B液；称取20 mg的 牛血清白蛋白溶于4.5 mL pH 8.8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液；在冰浴下，将B液逐滴滴 加到C液中，反应4 h，即得到戊唑醇免疫原混合液； 称取0.025 mmol的戊唑醇，向其中加入0.5 mL的Ν，Ν' 一二甲基甲酰胺，搅拌，溶解 得到A液；取Ν，Ν' 一羧基二咪唑0. 2 mmol加入到A液中，在37°C的水浴中搅拌，反应30 min,反应结束时，溶液无色透明，得到B液；称取20 mg的牛血清白蛋白或28 mg的鸡卵清 蛋白溶于4.5 mL pH 8.8的硼酸盐缓冲溶液中，为C液；在冰浴下，将B液逐滴滴加到C液 中，反应4 h，即得到戊唑醇包被原混合液。3. 如权利要求1所述的戊唑醇人工抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤二的具体 操作方法为，分别将戊唑醇包被原混合液和戊唑醇包被原混合液移入处理过的透析袋中， 用0.0 lmol/L pH 7. 2的的磷酸盐缓冲液透析，更换透析外液6-8次，分别除去戊唑醇免疫 原和包被原，即戊唑醇人工抗原，分别对其进行分装和保存。4. 如权利要求1-3其中之一所述的戊唑醇人工抗原的合成方法的应用，其特征在于： 所制备戊唑醇人工抗原应用于戊唑醇农药残留检测。
【专利摘要】本发明涉及一种戊唑醇人工抗原的合成方法及其应用；所属戊唑醇人工抗原包括免疫原和包被原；其合成方法为，将戊唑醇即(RS)-1-对氯苯基-4,4-二甲基-3-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)戊-3-醇，通过羧基二咪唑法和牛血清白蛋白BSA偶联，用作免疫原；然后将戊唑醇通过羧基二咪唑法和鸡卵清蛋白OVA相偶联，用作包被原；本发明成功合成了戊唑醇的人工抗原，合成步骤简单，有效，用该抗原可以制备出满足国内需求的戊唑醇抗体，并可以利用该抗体建立检测戊唑醇的各种免疫分析方法，为以后人们的研究提供了试验原料和简便的方法。
【IPC分类】C07K1/14, C07K14/77, C07K14/765, G01N33/53
【公开号】CN105061584
【申请号】CN201510415569
【发明人】陈秀金, 康怀彬, 马丽苹, 李松彪, 曹力, 李兆周, 孙军杰, 辛莉
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月16日