外周白介素35多肽及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及药物领域，具体涉及用于预防和治疗或预防类风湿性关节炎的多肽。
【背景技术】：
[0002] 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致 残因素之一。在全世界约为0.5%-1.0%，RA的发病在我国约为0.4%。RA可发生于任何 年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系 密切，男女之比约1: 3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、 多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕 部疼痛及肿胀（特别是腕背部的肿胀）为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可 以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显 的晨僵，通常可达1小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。
[0003] 类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜 炎。关节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯 软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响 关节的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系 统性疾病。
[0004] 目前治疗RA的药物分为两大类：控制症状药和控制疾病药。由于RA病因不明， 故当今并无堪称控制疾病的药。控制症状的抗风湿药分为四类：一、非留体类抗炎药，通常 称为一线药，这类药物种类繁多，国内市场已多达数十种。二、类固醇激素，激素是一个非常 好的止痛抗炎药，但长期单独使用不能改善病情，反而带来许多副作用，激素作为二线慢作 用药起效前的过渡性用是可以的，但用量要小，时间不宜过长。在病情较重，伴有关节外表 现的患者，短期治疗冲击，并联合二线药治疗时必须的。三、慢作用抗风湿药，通常称为二线 药，所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它们治疗RA起效慢，长期作 用对RA病情有一定缓解作用，故也称病情改善药。四、免疫多肽：常用有甲氨喋呤、环磷酰 胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。因此，急需开发更安全、有效的新型抗类风湿关节炎药物。
[0005] 白介素-35 (IL-35)是最近发现的抗炎性细胞因子，能够调节免疫反应，从而阻止 及延缓免疫性疾病的发生和发展。研究表明，在人体内它大部分是由调节性T细胞分泌，并 且是该细胞发挥免疫调节作用所必须的关键细胞因子。研究发现，IL-35与关节炎的密切 相关。细胞因子是免疫调节者，在周围淋巴组织和靶器官中的细胞因子在触发自身免疫性 关节炎的最初阶段发挥着强烈的影响作用。对敏感的个体，它可以推动关节的炎症与关节 的破坏。IL-35具有抑制免疫功能，可以有效地抑制炎症细胞因子和效应性T细胞分泌，阻 止TH17细胞分化、抑制其功能，影响IL-17水平和功能。Niedbala等用DBA/1小鼠建立胶 原诱导小鼠关节炎（CIA)模型，发现注射IL-35后小鼠关节炎的发生率和数量显著降低，临 床症状改善，组织病理学改变减轻，这一发现表明，IL-35是类风湿关节炎的一个潜在治疗 目标。尽管如此，并没有成熟开发的外周白介素35多肽问世，用于治疗RA。
【发明内容】
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[0006] 本发明目的是针对现有抗类风湿关节炎药物的特点，设计一种小分子的外周白介 素35多肽，适用于临床的治疗类风湿关节炎的应用。
[0007] 本发明技术方案是提供一种外周白介素35多肽，其序列为 EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV，及在治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
[0008] 有益结果：
[0009] 本发明中的外周白介素35多肽序列EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV，可以发挥白介素 35的作用，与白介素35受体产生的生理或病理的效应，达到预防或治疗类风湿性关节炎的 效果。
[0010] 发明人经过大量实验获知外周白介素35多肽能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎 和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节 炎的效果。说明本发明设计的外周白介素35多肽科学、合理、可行、有效，能作为治疗或预 防类风湿性关节炎药物。
【具体实施方式】
[0011] 本发明多肽由上海吉尔合成。
[0012] 实施例1
[0013] 外周白介素35多肽在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
[0014] 构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究外周白介素35多肽对小鼠胶原诱导性关 节炎（collagen induced arthritis，CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级 DBA/1小鼠60只（由上海西普尔-必凯实验动物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪）2008-0016)，雄性，7-8周龄，体重为 18-22g，随机分成6组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽低中高3个剂量组（0. 4,0. 8， 1.6mg/kg)和阳性药对照组（甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠 CIA模型，方法是鸡软骨II型胶原（c II )用0. lmol/1醋酸溶解成4mg/ml的溶液，于4°C冰 箱过夜。实验当天用 II 型胶原与含 4mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv 的完全弗氏佐剂（CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化 剂50 μ 1进行致敏，21d后用4mg/ml的II型胶原（c II )与不完全弗氏佐剂（IFA)等体积 充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30d起皮下注射给药：多肽 的3个剂量组（0. 4,0. 8,1. 6mg/kg):每日两次，连续10天；阳性药对照组（甲氨蝶呤2mg/ kg):每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组（生理盐水）：连续10天。分别于造 模后第40天关节评分、检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。
[0015] 外周白介素35多肽在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用具体结果 如下：外周白介素35多肽对小鼠胶原型关节炎关节肿胀度的影响，阳性对照组、外周白介 素35多肽高、中、低剂量组关节肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异（P〈0. 01)实验结 果具有统计学意义。外周白介素35多肽对小鼠胶原型关节炎足爪肿胀度的影响，阳性对 照组、外周白介素35多肽高、中、低剂量组足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异 (P〈0. 01)，实验结果具有统计学意义。多肽对胶原型关节炎小鼠关节评分的影响，多肽低、 中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组（P < 0. 01)，与模型对照组比较极显著性差异， 实验结果具有统计学意义。
[0016] 表1外周白介素35多肽对胶原型关节炎的影响（means土SD)
[0018] · *Ρ〈0· 05 ;林P〈0. 01 (和模型组比较）
[0019] 结论：外周白介素35多肽对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。
[0020] 实施例2
[0021] 外周白介素35多肽对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
[0022] 构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究多肽对佐剂性关节炎（Ad juvant arthritis，AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，SPF级SD大鼠60只（由上海西 普尔-必凯实验动物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，动物生产许 可证号码：SCXK (沪）2008-0016)，雄性，体重为140g-160g，随机分成6组，分别是正常对照 组，模型对照组，外周白介素35多肽低中高3个剂量组（0. 2,0. 4,0. 8mg/kg)和阳性药对照 组（甲氨蝶呤lmg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立大鼠 AA模型，方法是在大鼠的 左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌（H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐剂0. 08ml造成大 鼠佐剂性关节炎模型。造模第10天起皮下注射给药：多肽的3个剂量组（0. 2,0. 4,0. 8mg/ kg):每日两次，连续10天；阳性药对照组（甲氨蝶呤lmg/kg):每五天一次，连续3次；正常 对照组和模型对照组（生理盐水）：连续10天。分别于造模后第21天关节评分、检测左右 后足足踝直径来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。
[0023] 多肽在佐剂性大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用，具体结果如下：外周白介 素35多肽对大鼠原发性关节炎左后足踝直径的影响，大鼠阳性对照组、外周白介素35多肽 的低、中、高剂量组左后足踝直径与模型组比较，有极显著性差异（P〈〇. 01);外周白介素35 多肽对大鼠继发性关节炎右后足踝直径的影响，大鼠阳性对照组、外周白介素35多肽低、 中、高剂量组右后足踝直径与模型组比较，有显著性差异（P〈〇. 05)。外周白介素35多肽对 佐剂型关节炎大鼠关节评分的影响，多肽低、中、高剂量组四肢关节评分显著低于模型对照 组（P < 0. 05)，与模型对照组比较差异均有统计学意义。
[0024] 表2外周白介素35多肽对佐剂型关节炎的影响（means土SD)
[0025]
[0026] · *Ρ〈0· 〇5 ;**Ρ〈0· 01 (和模型组比较）
[0027] 结论：外周白介素35多肽对AA大鼠关节炎具有治疗作用。
【主权项】
1. 外周白介素35多肽，其特征在于其序列为EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV。2. 权利要求1的多肽在治疗和预防类风湿关节炎疾病中的应用。3. 根据权利要求2任一所述多肽的用途，其特征在于：可通过多种给药方式治疗和预 防类风湿关节炎疾病，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶 囊等，鼻喷剂等。
【专利摘要】本发明涉及药物领域，具体涉及外周白介素35，能预防和治疗类风湿性关节炎的多肽。其序列为EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV？是全新的序列，本发明的有益效果是可用于治疗类风湿性关节炎，具有潜在的新药开发价值。
【IPC分类】A61P19/02, C07K14/54, A61P29/00, A61K38/20
【公开号】CN105061583
【申请号】CN201510556864
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月5日